Дифференциальная диагностика узлов в легких, выявленных с помощью компьютерной томографии (КТ), остается сложной задачей в клинической практике.Здесь мы характеризуем глобальный метаболом 480 образцов сыворотки, включая контрольную группу здоровых людей, доброкачественные узелки в легких и аденокарциному легких I стадии.Аденокарциномы демонстрируют уникальные метаболомные профили, тогда как доброкачественные узелки и здоровые люди имеют большое сходство метаболомных профилей.В группе открытия (n = 306) был идентифицирован набор из 27 метаболитов, позволяющий дифференцировать доброкачественные и злокачественные узелки.AUC дискриминантной модели в группах внутренней проверки (n = 104) и внешней проверки (n = 111) составила 0,915 и 0,945 соответственно.Анализ путей выявил увеличение количества гликолитических метаболитов, связанное со снижением количества триптофана в сыворотке аденокарциномы легких по сравнению с доброкачественными узелками и здоровыми людьми, и предположил, что поглощение триптофана способствует гликолизу в клетках рака легких.Наше исследование подчеркивает ценность биомаркеров сывороточных метаболитов в оценке риска образования легочных узелков, обнаруженных с помощью КТ.
Ранняя диагностика имеет решающее значение для улучшения показателей выживаемости онкологических больных.Результаты национального исследования по скринингу рака легких в США (NLST) и европейского исследования NELSON показали, что скрининг с помощью низкодозной компьютерной томографии (LDCT) может значительно снизить смертность от рака легких в группах высокого риска1,2,3.С момента широкого использования LDCT для скрининга рака легких частота случайных рентгенографических находок бессимптомных легочных узелков продолжает увеличиваться 4 .Легочные узелки определяются как очаговые помутнения диаметром до 3 см 5 .Мы сталкиваемся с трудностями при оценке вероятности злокачественного новообразования и работе с большим количеством легочных узелков, случайно обнаруженных при LDCT.Ограничения КТ могут привести к частым последующим обследованиям и ложноположительным результатам, что приводит к ненужному вмешательству и чрезмерному лечению6.Таким образом, существует необходимость в разработке надежных и полезных биомаркеров для правильной идентификации рака легких на ранних стадиях и дифференциации большинства доброкачественных узлов при первоначальном обнаружении 7 .
Комплексный молекулярный анализ крови (сыворотки, плазмы, мононуклеарных клеток периферической крови), включая геномику, протеомику или метилирование ДНК8,9,10, привел к растущему интересу к открытию диагностических биомаркеров рака легких.Между тем, подходы метаболомики измеряют конечные клеточные продукты, на которые влияют эндогенные и экзогенные действия, и поэтому применяются для прогнозирования начала и исхода заболевания.Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС) является широко используемым методом метаболомных исследований благодаря своей высокой чувствительности и большому динамическому диапазону, который может охватывать метаболиты с различными физико-химическими свойствами11,12,13.Хотя глобальный метаболомный анализ плазмы/сыворотки использовался для идентификации биомаркеров, связанных с диагностикой рака легких14,15,16,17 и эффективностью лечения,18 классификаторы сывороточных метаболитов, позволяющие различать доброкачественные и злокачественные узелки в легких, еще предстоит тщательно изучить.-массовые исследования.
Аденокарцинома и плоскоклеточный рак являются двумя основными подтипами немелкоклеточного рака легких (НМРЛ).Различные скрининговые КТ-тесты показывают, что аденокарцинома является наиболее распространенным гистологическим типом рака легких1,19,20,21.В этом исследовании мы использовали сверхэффективную жидкостную хроматографию-масс-спектрометрию высокого разрешения (UPLC-HRMS) для выполнения метаболомного анализа в общей сложности 695 образцов сыворотки, включая здоровые контрольные образцы, доброкачественные легочные узелки и обнаруженные с помощью КТ ≤3 см.Скрининг аденокарциномы легких I стадии.Мы определили панель сывороточных метаболитов, которые отличают аденокарциному легких от доброкачественных узлов и здоровых людей.Анализ обогащения путей показал, что аномальный метаболизм триптофана и глюкозы является частым изменением при аденокарциноме легкого по сравнению с доброкачественными узлами и здоровыми людьми.Наконец, мы создали и утвердили метаболический классификатор сыворотки с высокой специфичностью и чувствительностью, позволяющий различать злокачественные и доброкачественные легочные узелки, обнаруженные с помощью LDCT, что может помочь в ранней дифференциальной диагностике и оценке риска.
В текущем исследовании образцы сыворотки, соответствующие полу и возрасту, были ретроспективно собраны у 174 здоровых людей из контрольной группы, 292 пациентов с доброкачественными узелками в легких и 229 пациентов с аденокарциномой легких I стадии.Демографические характеристики 695 субъектов показаны в дополнительной таблице 1.
Как показано на рисунке 1a, в онкологическом центре Университета Сунь Ятсена было собрано в общей сложности 480 образцов сыворотки, включая 174 образца здорового контроля (HC), 170 доброкачественных узлов (BN) и 136 образцов аденокарциномы легких I стадии (LA).Группа открытий для нецелевого метаболомного профилирования с использованием сверхэффективной жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-HRMS).Как показано на дополнительном рисунке 1, были идентифицированы дифференциальные метаболиты между LA и HC, LA и BN для создания модели классификации и дальнейшего изучения дифференциального анализа путей.104 образца, собранные Онкологическим центром Университета Сунь Ятсена, и 111 образцов, собранные двумя другими больницами, были подвергнуты внутренней и внешней проверке соответственно.
a Исследуемая популяция в группе открытия, которая прошла глобальный метаболомический анализ сыворотки с использованием сверхэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-HRMS).b Дискриминантный анализ частичного наименьших квадратов (PLS-DA) общего метаболома 480 образцов сыворотки из исследуемой когорты, включая здоровый контроль (HC, n = 174), доброкачественные узелки (BN, n = 170) и аденокарциному легкого I стадии. (Лос-Анджелес, n = 136).+ESI, режим положительной ионизации электрораспылением, -ESI, режим отрицательной ионизации электрораспылением.c–e Метаболиты со значительно разной численностью в двух заданных группах (двусторонний знаковый ранговый критерий Вилкоксона, значение p с поправкой на частоту ложных открытий, FDR <0,05) показаны красным (кратное изменение> 1,2) и синим (кратное изменение <0,83) .), показанный на изображении вулкана.f Тепловая карта иерархической кластеризации, показывающая значительные различия в количестве аннотированных метаболитов между LA и BN.Исходные данные предоставляются в виде файлов исходных данных.
Общий сывороточный метаболом 174 HC, 170 BN и 136 LA в группе открытия анализировали с использованием анализа UPLC-HRMS.Сначала мы показываем, что образцы контроля качества (QC) плотно группируются в центре модели неконтролируемого анализа главных компонентов (PCA), подтверждая стабильность результатов текущего исследования (дополнительный рисунок 2).
Как показано в частичном дискриминантном анализе наименьших квадратов (PLS-DA) на рисунке 1b, мы обнаружили, что существуют четкие различия между LA и BN, LA и HC в положительных (+ESI) и отрицательных (-ESI) режимах ионизации электрораспылением. .изолирован.Однако существенных различий между BN и HC в условиях +ESI и -ESI обнаружено не было.
Мы обнаружили 382 дифференциальных признака между LA и HC, 231 дифференциальный признак между LA и BN и 95 дифференциальных признаков между BN и HC (критерий знаковых рангов Уилкоксона, FDR <0,05 и множественные изменения >1,2 или <0,83) (рис. 1c-e). )..Пики были дополнительно аннотированы (дополнительные данные 3) в базе данных (библиотека mzCloud/HMDB/Chemspider) по значению m/z, времени удерживания и поиску масс-спектра фрагментации (подробности описаны в разделе «Методы») 22 .Наконец, 33 и 38 аннотированных метаболитов со значительными различиями в количестве были идентифицированы для LA по сравнению с BN (рис. 1f и дополнительная таблица 2) и LA по сравнению с HC (дополнительный рисунок 3 и дополнительная таблица 2) соответственно.Напротив, только 3 метаболита со значительными различиями в количестве были идентифицированы в BN и HC (дополнительная таблица 2), что согласуется с перекрытием между BN и HC в PLS-DA.Эти дифференциальные метаболиты охватывают широкий спектр биохимических веществ (дополнительный рисунок 4).В совокупности эти результаты демонстрируют значительные изменения в метаболоме сыворотки, которые отражают злокачественную трансформацию рака легких на ранней стадии по сравнению с доброкачественными узлами в легких или здоровыми субъектами.Между тем, сходство сывороточного метаболома BN и HC позволяет предположить, что доброкачественные легочные узелки могут иметь много общих биологических характеристик со здоровыми людьми.Учитывая, что мутации гена рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) часто встречаются при аденокарциноме легкого подтипа 23, мы стремились определить влияние драйверных мутаций на метаболом сыворотки.Затем мы проанализировали общий метаболомный профиль 72 случаев со статусом EGFR в группе аденокарциномы легких.Интересно, что мы обнаружили сопоставимые профили между пациентами с мутацией EGFR (n = 41) и пациентами с диким типом EGFR (n = 31) в анализе PCA (дополнительная фигура 5a).Тем не менее, мы идентифицировали 7 метаболитов, численность которых была значительно изменена у пациентов с мутацией EGFR по сравнению с пациентами с EGFR дикого типа (t-критерий, p <0,05 и кратность изменения> 1,2 или <0,83) (дополнительный рисунок 5b).Большинство этих метаболитов (5 из 7) представляют собой ацилкарнитины, которые играют важную роль в путях окисления жирных кислот.
Как показано в рабочем процессе, показанном на рисунке 2а, биомаркеры для классификации узелков были получены с использованием операторов наименьшего абсолютного сокращения и отбора на основе 33 дифференциальных метаболитов, идентифицированных в LA (n = 136) и BN (n = 170).Наилучшее сочетание переменных (LASSO) – модель бинарной логистической регрессии.Для проверки надежности модели использовалась десятикратная перекрестная проверка.Выбор переменных и регуляризация параметров корректируются штрафом максимизации правдоподобия с параметром λ24.Глобальный метаболомический анализ далее проводился независимо в группах внутренней проверки (n = 104) и внешней проверки (n = 111) для проверки эффективности классификации дискриминантной модели.В результате 27 метаболитов в наборе открытий были идентифицированы как лучшая дискриминантная модель с наибольшим средним значением AUC (рис. 2б), среди которых 9 имели повышенную активность, а 18 - пониженную активность в LA по сравнению с BN (рис. 2в).
Рабочий процесс создания классификатора легочных узелков, включая выбор лучшей панели сывороточных метаболитов в наборе обнаружения с использованием модели бинарной логистической регрессии посредством десятикратной перекрестной проверки и оценки прогнозирующей эффективности во внутренних и внешних наборах проверки.b Статистика перекрестной проверки регрессионной модели LASSO для выбора метаболических биомаркеров.Числа, приведенные выше, представляют собой среднее количество биомаркеров, выбранных при данном λ.Красная пунктирная линия представляет среднее значение AUC для соответствующей лямбды.Серые полосы ошибок представляют минимальное и максимальное значения AUC.Пунктирная линия указывает лучшую модель с 27 выбранными биомаркерами.AUC, площадь под кривой рабочей характеристики приемника (ROC).c Кратность изменения 27 выбранных метаболитов в группе LA по сравнению с группой BN в группе открытия.Красный столбец – активация.Синий столбец – снижение.d–f Кривые рабочих характеристик приемника (ROC), показывающие мощность дискриминантной модели, основанной на 27 комбинациях метаболитов в наборах обнаружения, внутренней и внешней проверки.Исходные данные предоставляются в виде файлов исходных данных.
Модель прогнозирования была создана на основе взвешенных коэффициентов регрессии этих 27 метаболитов (дополнительная таблица 3).ROC-анализ, основанный на этих 27 метаболитах, дал значение площади под кривой (AUC) 0,933, чувствительность группы открытия составила 0,868, а специфичность - 0,859 (рис. 2d).Между тем, среди 38 аннотированных дифференциальных метаболитов между LA и HC набор из 16 метаболитов достиг AUC 0,902 с чувствительностью 0,801 и специфичностью 0,856 при различении LA от HC (дополнительная фигура 6a-c).Также сравнивались значения AUC, основанные на различных порогах кратного изменения для дифференциальных метаболитов.Мы обнаружили, что модель классификации лучше всего работала при различении LA и BN (HC), когда уровень кратности изменения был установлен на 1,2 против 1,5 или 2,0 (дополнительный рисунок 7a,b).Модель классификации, основанная на 27 группах метаболитов, была дополнительно проверена во внутренних и внешних когортах.AUC составила 0,915 (чувствительность 0,867, специфичность 0,811) для внутренней проверки и 0,945 (чувствительность 0,810, специфичность 0,979) для внешней проверки (рис. 2д, е).Для оценки межлабораторной эффективности 40 образцов из внешней когорты были проанализированы во внешней лаборатории, как описано в разделе «Методы».Точность классификации достигла AUC 0,925 (дополнительный рисунок 8).Поскольку плоскоклеточный рак легких (LUSC) является вторым наиболее распространенным подтипом немелкоклеточного рака легких (НМРЛ) после аденокарциномы легких (LUAD), мы также проверили подтвержденную потенциальную полезность метаболических профилей.БН и 16 случаев LUSC.AUC дискриминации между LUSC и BN составил 0,776 (дополнительный рисунок 9), что указывает на более низкую способность по сравнению с дискриминацией между LUAD и BN.
Исследования показали, что размер узлов на КТ-изображениях положительно коррелирует с вероятностью злокачественного новообразования и остается основным фактором, определяющим лечение узлов25,26,27.Анализ данных большой когорты скринингового исследования NELSON показал, что риск злокачественного новообразования у субъектов с узлами <5 мм был даже аналогичен таковому у субъектов без узлов 28 .Таким образом, минимальный размер, требующий регулярного КТ-мониторинга, составляет 5 мм, как рекомендовано Британским торакальным обществом (BTS), и 6 мм, как рекомендовано Обществом Флейшнера 29 .Однако узлы размером более 6 мм и без очевидных доброкачественных особенностей, называемые неопределенными легочными узлами (IPN), остаются серьезной проблемой при оценке и лечении в клинической практике30,31.Затем мы исследовали, влияет ли размер узелков на метаболомные характеристики, используя объединенные образцы из когорт открытия и внутренней проверки.Сосредоточив внимание на 27 проверенных биомаркерах, мы сначала сравнили профили PCA метаболомов HC и BN размером менее 6 мм.Мы обнаружили, что большинство точек данных для HC и BN перекрываются, демонстрируя, что уровни метаболитов в сыворотке были одинаковыми в обеих группах (рис. 3a).Карты признаков в разных диапазонах размеров оставались консервативными в BN и LA (рис. 3b, c), тогда как наблюдалось разделение между злокачественными и доброкачественными узлами в диапазоне 6–20 мм (рис. 3d).Эта когорта имела AUC 0,927, специфичность 0,868 и чувствительность 0,820 для прогнозирования злокачественности узлов размером от 6 до 20 мм (рис. 3e, f).Наши результаты показывают, что классификатор может фиксировать метаболические изменения, вызванные ранней злокачественной трансформацией, независимо от размера узелков.
ad Сравнение профилей PCA между указанными группами на основе метаболического классификатора 27 метаболитов.СС и БН < 6 мм.б БН < 6 мм против БН 6–20 мм.в ЛП 6–20 мм против ЛП 20–30 мм.г БН 6–20 мм и ЛА 6–20 мм.ГК, n = 174;БН < 6 мм, n = 153;БН 6–20 мм, n = 91;ЛА 6–20 мм, n = 89;LA 20–30 мм, n = 77. e Кривая рабочей характеристики приемника (ROC), показывающая характеристики дискриминантной модели для узелков размером 6–20 мм.f Значения вероятности рассчитывались на основе модели логистической регрессии для узелков размером 6–20 мм.Серая пунктирная линия представляет оптимальное значение отсечки (0,455).Приведенные выше цифры представляют процент случаев, прогнозируемых в Лос-Анджелесе.Используйте двусторонний t-критерий Стьюдента.PCA, анализ главных компонент.Площадь AUC под кривой.Исходные данные предоставляются в виде файлов исходных данных.
Четыре образца (в возрасте 44–61 года) с одинаковыми размерами легочных узлов (7–9 мм) были дополнительно отобраны для иллюстрации эффективности предложенной модели прогнозирования злокачественных новообразований (рис. 4а, б).При первоначальном скрининге Случай 1 представлял собой твердый узел с кальцификацией, признак, связанный с доброкачественностью, тогда как Случай 2 представлял собой неопределенный частично твердый узел без очевидных доброкачественных признаков.Три раунда последующей компьютерной томографии показали, что эти случаи оставались стабильными в течение 4-летнего периода и поэтому считались доброкачественными узлами (рис. 4а).По сравнению с клинической оценкой серийных КТ, однократный анализ метаболитов сыворотки с использованием текущей модели классификатора быстро и правильно идентифицировал эти доброкачественные узелки на основе вероятностных ограничений (таблица 1).На рисунке 4б в случае 3 показан узел с признаками ретракции плевры, что чаще всего связано со злокачественным новообразованием32.Случай 4 представлял собой неопределенный частично солидный узел без признаков доброкачественной причины.Все эти случаи прогнозировались как злокачественные согласно модели-классификатору (табл. 1).Оценка аденокарциномы легкого была продемонстрирована с помощью гистопатологического исследования после операции по резекции легкого (рис. 4б).Для набора внешней проверки метаболический классификатор точно предсказал два случая неопределенных узлов в легких размером более 6 мм (дополнительный рисунок 10).
КТ-изображения аксиального окна легких двух случаев доброкачественных узлов.В случае 1 КТ через 4 года показала стабильный солидный узел размером 7 мм с кальцификацией в правой нижней доле.В случае 2 на КТ через 5 лет выявлен стабильный частично солидный узел диаметром 7 мм в правой верхней доле.б Аксиальные КТ-изображения легких и соответствующие патологические исследования двух случаев аденокарциномы I стадии перед резекцией легкого.В случае 3 выявлен узел диаметром 8 мм в правой верхней доле с ретракцией плевры.В случае 4 выявлен частично солидный узел по типу «матового стекла» размером 9 мм в левой верхней доле.Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) резецированной ткани легкого (масштабная линейка = 50 мкм), демонстрирующее ацинарный характер роста аденокарциномы легкого.Стрелки указывают узелки, обнаруженные на КТ-изображениях.Изображения H&E представляют собой репрезентативные изображения нескольких (>3) микроскопических полей, исследованных патологоанатомом.
В совокупности наши результаты демонстрируют потенциальную ценность биомаркеров сывороточных метаболитов в дифференциальной диагностике легочных узелков, что может создавать проблемы при оценке скрининга КТ.
На основе проверенной дифференциальной панели метаболитов мы стремились выявить биологические корреляты основных метаболических изменений.Анализ обогащения путей KEGG, проведенный MetaboAnalyst, выявил 6 общих значительно измененных путей между двумя данными группами (LA против HC и LA против BN, скорректированный p ≤ 0,001, эффект > 0,01).Эти изменения характеризовались нарушениями обмена пирувата, триптофана, ниацина и никотинамида, гликолиза, цикла ТЦА и пуринового обмена (рис. 5а).Затем мы дополнительно провели целенаправленную метаболомику для проверки основных изменений с использованием абсолютной количественной оценки.Определение общих метаболитов в обычно измененных путях с помощью тройной квадрупольной масс-спектрометрии (QQQ) с использованием аутентичных стандартов метаболитов.Демографические характеристики целевой выборки метаболомного исследования включены в дополнительную таблицу 4. В соответствии с нашими глобальными результатами метаболомики, количественный анализ подтвердил, что гипоксантин и ксантин, пируват и лактат были увеличены при LA по сравнению с BN и HC (рис. 5b, c, р<0,05).Однако существенных различий в этих метаболитах между BN и HC обнаружено не было.
Анализ обогащения пути KEGG значительно отличающимися метаболитами в группе LA по сравнению с группами BN и HC.Использовался двусторонний тест Globaltest, а значения p были скорректированы с использованием метода Холма-Бонферрони (скорректированное p ≤ 0,001 и размер эффекта > 0,01).b – d Графики скрипки, показывающие уровни гипоксантина, ксантина, лактата, пирувата и триптофана в сывороточных HC, BN и LA, определенные методом LC-MS/MS (n = 70 на группу).Белые и черные пунктирные линии обозначают медиану и квартиль соответственно.e График скрипки, показывающий нормализованную экспрессию мРНК Log2TPM (транскриптов на миллион) SLC7A5 и QPRT при аденокарциноме легких (n = 513) по сравнению с нормальной тканью легких (n = 59) в наборе данных LUAD-TCGA.Белый прямоугольник представляет собой межквартильный размах, горизонтальная черная линия в центре представляет медиану, а вертикальная черная линия, идущая от рамки, представляет 95% доверительный интервал (ДИ).f График корреляции Пирсона экспрессии SLC7A5 и GAPDH в аденокарциноме легкого (n = 513) и нормальной легочной ткани (n = 59) в наборе данных TCGA.Серая область представляет 95% ДИ.r, коэффициент корреляции Пирсона.g Нормализованные уровни клеточного триптофана в клетках A549, трансфицированных неспецифическим контролем shRNA (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), определенные методом ЖХ-МС/МС.Представлен статистический анализ пяти биологически независимых образцов в каждой группе.h Клеточные уровни НАДt (общий НАД, включая НАД+ и НАДН) в клетках A549 (NC) и клетках A549 с нокдауном SLC7A5 (Sh1, Sh2).Представлен статистический анализ трех биологически независимых образцов в каждой группе.i Гликолитическую активность клеток A549 до и после нокдауна SLC7A5 измеряли по скорости внеклеточного закисления (ECAR) (n = 4 биологически независимых образца на группу).2-ДГ,2-дезокси-D-глюкоза.Двусторонний t-критерий Стьюдента использовался в (b – h).В (g–i) полосы ошибок представляют собой среднее значение ± SD, каждый эксперимент проводился три раза независимо, и результаты были схожими.Исходные данные предоставляются в виде файлов исходных данных.
Учитывая значительное влияние измененного метаболизма триптофана в группе LA, мы также оценили уровни триптофана в сыворотке в группах HC, BN и LA с использованием QQQ.Мы обнаружили, что уровень триптофана в сыворотке был снижен при LA по сравнению с HC или BN (p <0,001, рисунок 5d), что согласуется с предыдущими данными о том, что уровни циркулирующего триптофана ниже у пациентов с раком легких, чем у здоровых людей из контрольной группы33,34 ,35.Другое исследование с использованием ПЭТ/КТ-индикатора 11C-метил-L-триптофана показало, что время удержания сигнала триптофана в тканях рака легких значительно увеличивается по сравнению с доброкачественными поражениями или нормальной тканью36.Мы предполагаем, что снижение триптофана в сыворотке МА может отражать активное поглощение триптофана клетками рака легких.
Также известно, что конечным продуктом кинуренинового пути катаболизма триптофана является НАД+37,38, который является важным субстратом реакции глицеральдегид-3-фосфата с 1,3-бисфосфоглицератом при гликолизе39.В то время как предыдущие исследования были сосредоточены на роли катаболизма триптофана в иммунной регуляции, мы стремились выяснить взаимодействие между нарушением регуляции триптофана и гликолитическими путями, наблюдаемыми в текущем исследовании.Член 5 семейства переносчиков растворенных веществ 7 (SLC7A5), как известно, является переносчиком триптофана43,44,45.Фосфорибозилтрансфераза хинолиновой кислоты (QPRT) представляет собой фермент, расположенный ниже кинуренинового пути, который превращает хинолиновую кислоту в NAMN46.Проверка набора данных LUAD TCGA показала, что как SLC7A5, так и QPRT значительно активизировались в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью (рис. 5e).Это увеличение наблюдалось на стадиях I и II, а также на стадиях III и IV аденокарциномы легких (дополнительный рисунок 11), что указывает на ранние нарушения метаболизма триптофана, связанные с онкогенезом.
Кроме того, набор данных LUAD-TCGA показал положительную корреляцию между экспрессией мРНК SLC7A5 и GAPDH в образцах больных раком (r = 0,45, p = 1,55E-26, рисунок 5f).Напротив, между такими сигнатурами генов в нормальной легочной ткани не было обнаружено значимой корреляции (r = 0,25, p = 0,06, рисунок 5f).Нокдаун SLC7A5 (дополнительный рисунок 12) в клетках A549 значительно снижал клеточные уровни триптофана и НАД (H) (рис. 5g, h), что приводило к ослаблению гликолитической активности, измеряемой по скорости внеклеточного закисления (ECAR) (рис. 1).5и).Таким образом, основываясь на метаболических изменениях в сыворотке и обнаружении in vitro, мы предполагаем, что метаболизм триптофана может продуцировать НАД+ через кинурениновый путь и играть важную роль в стимулировании гликолиза при раке легких.
Исследования показали, что большое количество неопределенных легочных узелков, обнаруженных с помощью LDCT, может привести к необходимости дополнительных исследований, таких как ПЭТ-КТ, биопсия легких и чрезмерному лечению из-за ложноположительного диагноза злокачественного новообразования.31 Как показано на рисунке 6, Наше исследование выявило панель сывороточных метаболитов с потенциальной диагностической ценностью, которая может улучшить стратификацию риска и последующее лечение легочных узлов, обнаруженных с помощью КТ.
Легочные узелки оцениваются с помощью низкодозной компьютерной томографии (LDCT) с признаками визуализации, позволяющими предположить доброкачественные или злокачественные причины.Неопределенный исход узелков может привести к частым последующим визитам, ненужным вмешательствам и чрезмерному лечению.Включение метаболических классификаторов сыворотки крови, имеющих диагностическую ценность, может улучшить оценку риска и последующее лечение легочных узелков.ПЭТ-позитронно-эмиссионная томография.
Данные американского исследования NLST и европейского исследования NELSON показывают, что скрининг групп высокого риска с помощью низкодозной компьютерной томографии (LDCT) может снизить смертность от рака легких1,3.Однако оценка риска и последующее клиническое лечение большого количества случайных легочных узелков, обнаруженных с помощью LDCT, остаются наиболее сложными.Основная цель — оптимизировать правильную классификацию существующих протоколов на основе LDCT путем включения надежных биомаркеров.
Определенные молекулярные биомаркеры, такие как метаболиты крови, были идентифицированы путем сравнения рака легких со здоровыми людьми15,17.В текущем исследовании мы сосредоточились на применении метаболомического анализа сыворотки, чтобы различать доброкачественные и злокачественные легочные узелки, случайно обнаруженные с помощью LDCT.Мы сравнили глобальный метаболом сыворотки образцов здорового контроля (HC), доброкачественных узелков легких (BN) и аденокарциномы легких I стадии (LA) с использованием анализа UPLC-HRMS.Мы обнаружили, что HC и BN имели схожие метаболические профили, тогда как LA показал значительные изменения по сравнению с HC и BN.Мы идентифицировали два набора сывороточных метаболитов, которые отличают LA от HC и BN.
Текущая схема идентификации доброкачественных и злокачественных узлов на основе LDCT в основном основана на размере, плотности, морфологии и скорости роста узлов с течением времени30.Предыдущие исследования показали, что размер узелков тесно связан с вероятностью рака легких.Даже у пациентов группы высокого риска риск малигнизации узлов <6 мм составляет <1%.Риск малигнизации узлов размером от 6 до 20 мм колеблется от 8% до 64%30.Поэтому Общество Флейшнера рекомендует для рутинного наблюдения за компьютерной томографией диаметр отсечки 6 мм.29 Однако оценка риска и лечение неопределенных легочных узелков (IPN) размером более 6 мм не были проведены адекватно 31 .Текущее лечение врожденных пороков сердца обычно основано на бдительном ожидании с частым мониторингом КТ.
На основе подтвержденного метаболома мы впервые продемонстрировали совпадение метаболомных признаков между здоровыми людьми и доброкачественными узлами <6 мм.Биологическое сходство согласуется с предыдущими данными КТ о том, что риск злокачественного новообразования для узлов <6 мм так же низок, как и для субъектов без узлов.30 Следует отметить, что наши результаты также демонстрируют, что доброкачественные узлы <6 мм и ≥6 мм имеют высокий риск злокачественного новообразования. сходство метаболомных профилей позволяет предположить, что функциональное определение доброкачественной этиологии единообразно независимо от размера узелков.Таким образом, современные диагностические панели метаболитов сыворотки могут обеспечить единственный анализ в качестве исключающего теста, когда узелки первоначально обнаруживаются на КТ, и потенциально уменьшить серийный мониторинг.В то же время та же панель метаболических биомаркеров отличала злокачественные узлы размером ≥6 мм от доброкачественных узлов и обеспечивала точные прогнозы для ВПС аналогичного размера и неоднозначных морфологических особенностей на КТ-изображениях.Этот классификатор метаболизма сыворотки хорошо показал себя при прогнозировании злокачественности узлов размером ≥6 мм с AUC 0,927.В совокупности наши результаты показывают, что уникальные метаболомические характеристики сыворотки могут специфически отражать ранние метаболические изменения, вызванные опухолью, и иметь потенциальную ценность в качестве предикторов риска, независимо от размера узелков.
Примечательно, что аденокарцинома легких (LUAD) и плоскоклеточный рак (LUSC) являются основными типами немелкоклеточного рака легких (НМРЛ).Учитывая, что LUSC тесно связан с употреблением табака47, а LUAD является наиболее распространенной гистологией случайных узелков в легких, обнаруживаемых при КТ-скрининге48, наша модель классификатора была специально построена для образцов аденокарциномы I стадии.Ван и его коллеги также сосредоточились на LUAD и определили девять липидных сигнатур с помощью липидомики, чтобы отличить раннюю стадию рака легких от здоровых людей17.Мы протестировали текущую модель классификатора на 16 случаях LUSC I стадии и 74 доброкачественных узлах и наблюдали низкую точность прогнозирования LUSC (AUC 0,776), что позволяет предположить, что LUAD и LUSC могут иметь свои собственные метаболомные признаки.Действительно, было показано, что LUAD и LUSC различаются по этиологии, биологическому происхождению и генетическим аберрациям49.Следовательно, другие типы гистологии должны быть включены в обучающие модели для популяционного выявления рака легких в программах скрининга.
Здесь мы определили шесть наиболее часто изменяющихся путей при аденокарциноме легких по сравнению со здоровыми людьми и доброкачественными узлами.Ксантин и гипоксантин являются распространенными метаболитами пуринового метаболического пути.В соответствии с нашими результатами, промежуточные соединения, связанные с метаболизмом пуринов, были значительно увеличены в сыворотке или тканях пациентов с аденокарциномой легких по сравнению со здоровыми людьми из контрольной группы или пациентами на преинвазивной стадии15,50.Повышенные уровни ксантина и гипоксантина в сыворотке могут отражать анаболизм, необходимый быстро пролиферирующим раковым клеткам.Нарушение регуляции метаболизма глюкозы является хорошо известным признаком метаболизма рака51.Здесь мы наблюдали значительное увеличение пирувата и лактата в группе LA по сравнению с группой HC и BN, что согласуется с предыдущими сообщениями об аномалиях гликолитического пути в профилях метаболома сыворотки пациентов с немелкоклеточным раком легких (НМРЛ) и здоровый контроль.результаты согласуются52,53.
Важно отметить, что мы наблюдали обратную корреляцию между метаболизмом пирувата и триптофана в сыворотке аденокарцином легких.Уровни триптофана в сыворотке были снижены в группе LA по сравнению с группой HC или BN.Интересно, что предыдущее крупномасштабное исследование с использованием проспективной когорты показало, что низкие уровни циркулирующего триптофана были связаны с повышенным риском рака легких 54 .Триптофан – незаменимая аминокислота, которую мы получаем исключительно с пищей.Мы пришли к выводу, что истощение триптофана в сыворотке крови при аденокарциноме легких может отражать быстрое истощение этого метаболита.Хорошо известно, что конечный продукт катаболизма триптофана по кинурениновому пути является источником синтеза НАД+ de novo.Поскольку НАД+ вырабатывается в основном по пути спасения, важность НАД+ в метаболизме триптофана в норме и при заболеваниях еще предстоит определить46.Наш анализ базы данных TCGA показал, что экспрессия транспортера растворенного вещества триптофана 7A5 (SLC7A5) была значительно увеличена при аденокарциноме легких по сравнению с нормальным контролем и положительно коррелировала с экспрессией гликолитического фермента GAPDH.Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на роли катаболизма триптофана в подавлении противоопухолевого иммунного ответа40,41,42.Здесь мы демонстрируем, что ингибирование захвата триптофана путем нокдауна SLC7A5 в клетках рака легких приводит к последующему снижению клеточных уровней НАД и сопутствующему ослаблению гликолитической активности.Таким образом, наше исследование обеспечивает биологическую основу для изменений метаболизма сыворотки, связанных со злокачественной трансформацией аденокарциномы легких.
Мутации EGFR являются наиболее распространенными драйверными мутациями у пациентов с НМРЛ.В нашем исследовании мы обнаружили, что пациенты с мутацией EGFR (n = 41) имели общие метаболомные профили, аналогичные пациентам с EGFR дикого типа (n = 31), хотя мы обнаружили снижение уровней в сыворотке некоторых пациентов с мутацией EGFR у пациентов с ацилкарнитином.Установленная функция ацилкарнитинов заключается в транспортировке ацильных групп из цитоплазмы в митохондриальный матрикс, что приводит к окислению жирных кислот с получением энергии 55 .В соответствии с нашими выводами, недавнее исследование также выявило сходные профили метаболома между мутантными EGFR и опухолями дикого типа EGFR путем анализа глобального метаболома 102 образцов ткани аденокарциномы легких50.Интересно, что содержание ацилкарнитина также было обнаружено в группе мутантов EGFR.Следовательно, вопрос о том, отражают ли изменения в уровнях ацилкарнитина метаболические изменения, вызванные EGFR, и лежащие в их основе молекулярные пути, может заслуживать дальнейшего изучения.
В заключение, наше исследование устанавливает метаболический классификатор сыворотки для дифференциальной диагностики легочных узелков и предлагает рабочий процесс, который может оптимизировать оценку риска и облегчить клиническое ведение на основе скрининга КТ.
Это исследование было одобрено комитетом по этике онкологической больницы Университета Сунь Ятсена, Первой дочерней больницей Университета Сунь Ятсена и комитетом по этике онкологической больницы университета Чжэнчжоу.В группах открытия и внутренней проверки 174 сыворотки от здоровых людей и 244 сыворотки от доброкачественных узлов были собраны у лиц, проходящих ежегодные медицинские осмотры в Департаменте контроля и профилактики рака Онкологического центра Университета Сунь Ятсена, и 166 доброкачественных узлов.сыворотка.Аденокарциномы легких I стадии были собраны в онкологическом центре Университета Сунь Ятсена.В когорте внешней валидации было 48 случаев доброкачественных узлов, 39 случаев аденокарциномы легких I стадии из Первой дочерней больницы Университета Сунь Ятсена и 24 случая аденокарциномы легких I стадии из онкологической больницы Чжэнчжоу.Онкологический центр Университета Сунь Ятсена также собрал 16 случаев плоскоклеточного рака легкого I стадии, чтобы проверить диагностическую способность установленного метаболического классификатора (характеристики пациентов показаны в дополнительной таблице 5).Образцы из когорты открытия и когорты внутренней проверки были собраны в период с января 2018 года по май 2020 года. Образцы для когорты внешней проверки собирались в период с августа 2021 года по октябрь 2022 года. Чтобы минимизировать гендерную предвзятость, в каждую группу было отнесено примерно равное количество случаев мужского и женского пола. когорта.Группа обнаружения и группа внутренней проверки.Пол участника определялся на основе самоотчета.От всех участников было получено информированное согласие, компенсация не была предоставлена.Субъектами с доброкачественными узлами были пациенты со стабильной оценкой КТ в течение 2–5 лет на момент анализа, за исключением 1 случая из внешней проверочной выборки, которая была собрана до операции и диагностирована гистопатологией.За исключением хронического бронхита.Случаи аденокарциномы легких собирали перед резекцией легкого и подтверждали патологоанатомическим диагнозом.Образцы крови натощак собирали в пробирки для отделения сыворотки без каких-либо антикоагулянтов.Образцы крови свертывали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 2851×g в течение 10 минут при 4°C для сбора супернатанта сыворотки.Аликвоты сыворотки замораживали при -80°С до экстракции метаболита.Отделение профилактики рака и медицинского обследования Онкологического центра Университета Сунь Ятсена собрало пул сывороток от 100 здоровых доноров, включая равное количество мужчин и женщин в возрасте от 40 до 55 лет.Смешивали равные объемы каждого донорского образца, полученный пул разделяли на аликвоты и хранили при -80°С.Смесь сывороток использовали в качестве эталонного материала для контроля качества и стандартизации данных.
Эталонная сыворотка и тестируемые образцы были разморожены, а метаболиты экстрагированы с использованием комбинированного метода экстракции (МТБЭ/метанол/вода) 56 .Вкратце, 50 мкл сыворотки смешивали с 225 мкл ледяного метанола и 750 мкл ледяного метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ).Перемешайте смесь и инкубируйте на льду в течение 1 часа.Затем образцы смешивали и смешивали на вортексе со 188 мкл воды MS-класса, содержащей внутренние стандарты (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолейцин, приобретенные у Cambridge Isotope Laboratories).Затем смесь центрифугировали при 15 000×g в течение 10 мин при 4 °С, а нижнюю фазу переносили в две пробирки (по 125 мкл каждая) для анализа ЖХ-МС в положительном и отрицательном режимах.Наконец, образец упаривали досуха в высокоскоростном вакуумном концентраторе.
Высушенные метаболиты восстанавливали в 120 мкл 80%-ного ацетонитрила, перемешивали на встряхивании в течение 5 минут и центрифугировали при 15 000×g в течение 10 минут при 4°C.Супернатанты переносили во флаконы из янтарного стекла с микровставками для метаболомических исследований.Нецелевой метаболомный анализ на сверхэффективной платформе жидкостной хроматографии и масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-HRMS).Метаболиты разделяли с использованием системы Dionex Ultimate 3000 UPLC и колонки ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters).В режиме положительных ионов подвижные фазы представляли собой 95% (А) и 50% ацетонитрила (В), каждая из которых содержала 10 ммоль/л ацетата аммония и 0,1% муравьиной кислоты.В отрицательном режиме подвижные фазы А и Б содержали 95 и 50 % ацетонитрила соответственно, обе фазы содержали 10 ммоль/л ацетата аммония, рН = 9. Градиентная программа была следующей: 0–0,5 мин, 2 % В;0,5–12 мин, 2–50% Б;12–14 мин, 50–98% Б;14–16 мин, 98% Б;16–16.1.мин, 98 –2% Б;16,1–20 мин, 2% B. Колонку поддерживали при 40°C, а образец – при 10°C в автосамплере.Скорость потока составляла 0,3 мл/мин, объем инъекции – 3 мкл.Масс-спектрометр Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) с источником ионизации электрораспылением (ESI) работал в режиме полного сканирования и в сочетании с режимом мониторинга ddMS2 для сбора больших объемов данных.Параметры МС были заданы следующие: напряжение распыления +3,8 кВ/- 3,2 кВ, температура капилляра 320°С, защитный газ 40 усл, вспомогательный газ 10 усл, температура нагревателя зонда 350°С, диапазон сканирования 70–1050 м/ч, разрешение.70 000. Данные были получены с использованием Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Для оценки качества данных были получены объединенные образцы контроля качества (КК) путем удаления аликвот супернатанта по 10 мкл из каждого образца.В начале аналитической последовательности анализировали шесть введенных проб для контроля качества для оценки стабильности системы UPLC-MS.Затем в партию периодически вводятся образцы для контроля качества.Все 11 партий образцов сыворотки в этом исследовании были проанализированы методом ЖХ-МС.Аликвоты смеси пула сыворотки от 100 здоровых доноров использовали в качестве эталонного материала в соответствующих партиях для мониторинга процесса экстракции и корректировки эффектов от партии к партии.Нецелевой метаболомический анализ когорты открытий, когорты внутренней проверки и когорты внешней проверки был проведен в Центре метаболомики Университета Сунь Ятсена.Внешняя лаборатория Центра анализа и тестирования Технологического университета Гуандуна также проанализировала 40 образцов из внешней когорты, чтобы проверить эффективность модели классификатора.
После экстракции и восстановления абсолютное количественное определение сывороточных метаболитов измеряли с использованием сверхвысокоэффективной жидкостной хроматографии и тандемной масс-спектрометрии (тройной квадруполь Agilent 6495) с источником ионизации электрораспылением (ESI) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM).Для разделения метаболитов использовали колонку ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters).Подвижная фаза состояла из 90% (А) и 5% ацетонитрила (Б) с 10 ммоль/л ацетата аммония и 0,1% раствора аммиака.Градиентная программа была следующей: 0–1,5 мин, 0% Б;1,5–6,5 мин, 0–15% Б;6,5–8 мин, 15% Б;8–8,5 мин, 15–0% В;8,5–11,5 мин, 0%В.Колонку поддерживали при 40 °C, а образец — при 10 °C в автосамплере.Скорость потока составляла 0,3 мл/мин, а объем инъекции — 1 мкл.Параметры МС были установлены следующим образом: капиллярное напряжение ±3,5 кВ, давление в распылителе 35 фунтов на квадратный дюйм, поток оболочного газа 12 л/мин, температура оболочного газа 350°C, температура осушающего газа 250°C и поток осушающего газа 14 л/мин.Конверсии MRM триптофана, пирувата, лактата, гипоксантина и ксантина составили 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 и 151,0–107.9 соответственно.Данные собирали с помощью Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies).Для образцов сыворотки количественно определяли триптофан, пируват, лактат, гипоксантин и ксантин с использованием калибровочных кривых растворов стандартных смесей.В образцах клеток содержание триптофана нормировали по внутреннему стандарту и массе клеточного белка.
Экстракцию пиков (m/z и время удерживания (RT)) проводили с использованием Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific).Чтобы исключить потенциальные различия между партиями, каждый характеристический пик тестируемого образца делили на характеристический пик эталонного материала из той же партии для получения относительного содержания.Относительные стандартные отклонения внутренних стандартов до и после стандартизации показаны в дополнительной таблице 6. Различия между двумя группами характеризовались частотой ложных обнаружений (FDR <0,05, знаковый ранговый критерий Уилкоксона) и кратностью изменения (> 1,2 или <0,83).Необработанные данные МС по извлеченным признакам и эталонные данные МС с коррекцией по сыворотке показаны в дополнительных данных 1 и дополнительных данных 2 соответственно.Аннотацию пиков проводили на основе четырех определенных уровней идентификации, включая идентифицированные метаболиты, предположительно аннотированные соединения, предположительно охарактеризованные классы соединений и неизвестные соединения 22 .На основе поиска в базе данных в Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) биологические соединения с МС/МС, соответствующими проверенным стандартам или аннотациями с точным соответствием в mzCloud (оценка > 85) или Chemspider, были окончательно выбраны в качестве промежуточных между дифференциальным метаболомом.Аннотации пиков для каждого признака включены в дополнительные данные 3. MetaboAnalyst 5.0 использовался для одномерного анализа нормализованного по сумме содержания метаболитов.MetaboAnalyst 5.0 также оценил анализ обогащения пути KEGG на основе значительно разных метаболитов.Анализ главных компонентов (PCA) и дискриминантный анализ частичных наименьших квадратов (PLS-DA) анализировались с использованием программного пакета ropls (v.1.26.4) с нормализацией стека и автомасштабированием.Оптимальная модель биомаркера метаболита для прогнозирования злокачественности узелков была создана с использованием бинарной логистической регрессии с наименьшим абсолютным сокращением и оператором отбора (LASSO, пакет R v.4.1-3).Работоспособность дискриминантной модели в наборах обнаружения и проверки характеризовали путем оценки AUC на основе ROC-анализа согласно пакету pROC (v.1.18.0.).Оптимальное отсечение вероятности было получено на основе максимального индекса Юдена модели (чувствительность + специфичность – 1).Образцы со значениями меньше или выше порогового значения будут прогнозироваться как доброкачественные узелки и аденокарцинома легких соответственно.
Клетки А549 (#CCL-185, Американская коллекция типовых культур) выращивали в среде F-12K, содержащей 10% FBS.Последовательности короткой шпилечной РНК (shRNA), нацеленные на SLC7A5, и ненацеленный контроль (NC) были вставлены в лентивирусный вектор pLKO.1-puro.Антисмысловые последовательности shSLC7A5 следующие: Sh1 (5'-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3'), Sh2 (5'-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3').Антитела к SLC7A5 (#5347) и тубулину (#2148) были приобретены у Cell Signaling Technology.Антитела к SLC7A5 и тубулину использовали в разведении 1:1000 для вестерн-блот-анализа.
Гликолитический стресс-тест Seahorse XF измеряет уровни внеклеточного закисления (ECAR).В этом анализе глюкозу, олигомицин А и 2-DG вводили последовательно для проверки клеточной гликолитической способности, измеренной с помощью ECAR.
Клетки A549, трансфицированные ненацеленным контролем (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), высевали на ночь в чашки диаметром 10 см.Клеточные метаболиты экстрагировали 1 мл ледяного 80% водного метанола.Клетки в метанольном растворе соскабливали, собирали в новую пробирку и центрифугировали при 15 000×g в течение 15 мин при 4°С.Соберите 800 мкл супернатанта и высушите с помощью высокоскоростного вакуумного концентратора.Затем высушенные гранулы метаболита анализировали на уровни триптофана с использованием ЖХ-МС/МС, как описано выше.Клеточные уровни НАД(Н) в клетках А549 (NC и shSLC7A5) измеряли с использованием колориметрического набора для количественного НАД+/НАДН (#K337, BioVision) в соответствии с инструкциями производителя.Уровни белка измеряли для каждого образца для нормализации количества метаболитов.
Для предварительного определения размера выборки не использовались статистические методы.Предыдущие метаболомические исследования, направленные на открытие биомаркеров15,18, считались ориентирами для определения размера, и по сравнению с этими отчетами наша выборка была адекватной.Ни один образец не был исключен из исследуемой когорты.Образцы сыворотки были случайным образом распределены в группу открытия (306 случаев, 74,6%) и группу внутренней проверки (104 случая, 25,4%) для нецелевых метаболомических исследований.Мы также случайным образом выбрали 70 случаев из каждой группы из набора исследований для целевых метаболомических исследований.Исследователи не знали о групповом распределении во время сбора и анализа данных LC-MS.Статистический анализ данных метаболомики и клеточных экспериментов описан в соответствующих разделах «Результаты», «Подписи к рисункам» и «Методы».Количественную оценку клеточного триптофана, НАДТ и гликолитической активности проводили три раза независимо с идентичными результатами.
Для получения дополнительной информации о дизайне исследования см. Аннотация отчета о естественном портфеле, связанную с этой статьей.
Необработанные данные МС извлеченных признаков и нормализованные данные МС эталонной сыворотки показаны в дополнительных данных 1 и дополнительных данных 2 соответственно.Аннотации пиков для дифференциальных признаков представлены в дополнительных данных 3. Набор данных LUAD TCGA можно загрузить с https://portal.gdc.cancer.gov/.Входные данные для построения графика предоставлены в исходных данных.Исходные данные приведены для данной статьи.
Национальная исследовательская группа по скринингу легких и т. д. Снижение смертности от рака легких с помощью низкодозной компьютерной томографии.Северная Англия.Дж. Мед.365, 395–409 (2011).
Крамер Б.С., Берг К.Д., Аберл Д.Р. и Профет П.С. Скрининг рака легких с использованием низкодозной спиральной КТ: результаты Национального исследования скрининга легких (NLST).Дж. Мед.Экран 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, HJ и др.Снижение смертности от рака легких с помощью объемного КТ-скрининга в рандомизированном исследовании.Северная Англия.Дж. Мед.382, 503–513 (2020).
Время публикации: 18 сентября 2023 г.