Дифференциальная диагностика легочных узлов, выявленных с помощью компьютерной томографии (КТ), остается сложной задачей в клинической практике. В данном исследовании мы охарактеризовали глобальный метаболом 480 образцов сыворотки крови, включая образцы здоровых контрольных лиц, доброкачественных легочных узлов и аденокарциномы легких I стадии. Аденокарциномы демонстрируют уникальные метаболомные профили, в то время как доброкачественные узлы и здоровые люди имеют высокую степень сходства в метаболомных профилях. В группе обнаружения (n = 306) был идентифицирован набор из 27 метаболитов для дифференциации доброкачественных и злокачественных узлов. AUC дискриминантной модели во внутренней валидационной (n = 104) и внешней валидационной (n = 111) группах составил 0,915 и 0,945 соответственно. Анализ метаболических путей выявил повышенное содержание гликолитических метаболитов, связанное со снижением уровня триптофана в сыворотке крови пациентов с аденокарциномой легких, по сравнению с доброкачественными узлами и здоровыми контрольными группами, и показал, что поглощение триптофана способствует гликолизу в клетках рака легких. Наше исследование подчеркивает ценность биомаркеров метаболитов в сыворотке крови для оценки риска развития легочных узлов, выявляемых с помощью КТ.
Ранняя диагностика имеет решающее значение для повышения выживаемости онкологических больных. Результаты Национального исследования скрининга рака легких в США (NLST) и Европейского исследования NELSON показали, что скрининг с помощью низкодозовой компьютерной томографии (НДКТ) может значительно снизить смертность от рака легких в группах высокого риска1,2,3. С момента широкого использования НДКТ для скрининга рака легких частота случайных рентгенологических находок бессимптомных легочных узлов продолжает расти4. Легочные узлы определяются как очаговые затемнения диаметром до 3 см5. Мы сталкиваемся с трудностями в оценке вероятности злокачественности и в работе с большим количеством легочных узлов, обнаруженных случайно при НДКТ. Ограничения КТ могут приводить к частым контрольным обследованиям и ложноположительным результатам, что ведет к ненужным вмешательствам и чрезмерному лечению6. Поэтому существует необходимость в разработке надежных и полезных биомаркеров для правильной идентификации рака легких на ранних стадиях и дифференциации большинства доброкачественных узлов при первичном обнаружении7.
Комплексный молекулярный анализ крови (сыворотки, плазмы, мононуклеарных клеток периферической крови), включая геномику, протеомику или метилирование ДНК8,9,10, привел к росту интереса к поиску диагностических биомаркеров рака легких. В то же время, метаболомические подходы измеряют конечные продукты клеток, на которые влияют эндогенные и экзогенные факторы, и поэтому применяются для прогнозирования начала и исхода заболевания. Жидкостная хроматография-тандемная масс-спектрометрия (ЖХ-МС) является широко используемым методом метаболомических исследований благодаря своей высокой чувствительности и большому динамическому диапазону, который может охватывать метаболиты с различными физико-химическими свойствами11,12,13. Хотя глобальный метаболомический анализ плазмы/сыворотки использовался для идентификации биомаркеров, связанных с диагностикой рака легких14,15,16,17 и эффективностью лечения18, классификаторы метаболитов сыворотки для различения доброкачественных и злокачественных узлов легких еще нуждаются в тщательном изучении.
Аденокарцинома и плоскоклеточная карцинома являются двумя основными подтипами немелкоклеточного рака легких (НМРЛ). Различные скрининговые КТ-исследования показывают, что аденокарцинома является наиболее распространенным гистологическим типом рака легких1,19,20,21. В этом исследовании мы использовали высокоэффективную жидкостную хроматографию с масс-спектрометрией высокого разрешения (UPLC-HRMS) для проведения метаболомного анализа в общей сложности 695 образцов сыворотки, включая образцы здоровых контрольных лиц, доброкачественные легочные узлы и образцы размером ≤3 см, выявленные при КТ-скрининге на аденокарциному легких I стадии. Мы идентифицировали панель метаболитов сыворотки, которые отличают аденокарциному легких от доброкачественных узлов и здоровых контрольных лиц. Анализ обогащения метаболических путей показал, что аномальный метаболизм триптофана и глюкозы является распространенным изменением при аденокарциноме легких по сравнению с доброкачественными узлами и здоровыми контрольными лицами. В заключение, мы разработали и валидировали классификатор метаболизма сыворотки крови с высокой специфичностью и чувствительностью для различения злокачественных и доброкачественных легочных узлов, выявляемых с помощью низкодозовой компьютерной томографии, что может помочь в ранней дифференциальной диагностике и оценке риска.
В данном исследовании ретроспективно были собраны образцы сыворотки крови, соответствующие по полу и возрасту, у 174 здоровых контрольных лиц, 292 пациентов с доброкачественными легочными узлами и 229 пациентов с аденокарциномой легких I стадии. Демографические характеристики 695 участников исследования представлены в дополнительной таблице 1.
Как показано на рисунке 1a, в Онкологическом центре Университета Сунь Ятсена было собрано в общей сложности 480 образцов сыворотки, включая 174 образца от здоровых контрольных лиц (HC), 170 образцов доброкачественных узлов (BN) и 136 образцов аденокарциномы легких I стадии (LA). Была сформирована исследовательская когорта для нецелевого метаболомного профилирования с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-HRMS). Как показано на дополнительном рисунке 1, были идентифицированы дифференциальные метаболиты между LA и HC, а также между LA и BN для создания классификационной модели и дальнейшего изучения дифференциального анализа метаболических путей. 104 образца, собранных Онкологическим центром Университета Сунь Ятсена, и 111 образцов, собранных двумя другими больницами, были подвергнуты внутренней и внешней валидации соответственно.
a. Исследуемая популяция в когорте для выявления закономерностей, прошедшая глобальный анализ метаболомики сыворотки с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-HRMS). b. Дискриминантный анализ методом частичных наименьших квадратов (PLS-DA) общего метаболома 480 образцов сыворотки из исследуемой когорты, включая здоровых контрольных лиц (HC, n = 174), доброкачественные узлы (BN, n = 170) и аденокарциному легких I стадии (Лос-Анджелес, n = 136). +ESI, режим положительной электроспрейной ионизации, -ESI, режим отрицательной электроспрейной ионизации. c–e. Метаболиты со значительно различающейся концентрацией в двух заданных группах (двусторонний критерий знаковых рангов Вилкоксона, p-значение с поправкой на ложноположительные результаты, FDR <0,05) показаны красным (изменение в 1,2 раза > 1,2 раза) и синим (изменение в 0,83 раза < 0,83 раза). ) показаны на графике «вулкан». f. Тепловая карта иерархической кластеризации, показывающая существенные различия в количестве аннотированных метаболитов между LA и BN. Исходные данные представлены в виде файлов исходных данных.
С помощью анализа UPLC-HRMS был проведен анализ общего метаболома сыворотки крови 174 HC, 170 BN и 136 LA в группе исследования. Сначала мы показали, что образцы контроля качества (QC) плотно группируются в центре модели анализа главных компонентов (PCA) без предварительного обучения, что подтверждает стабильность результатов данного исследования (дополнительный рисунок 2).
Как показано на рисунке 1b в результате дискриминантного анализа методом частичных наименьших квадратов (PLS-DA), мы обнаружили явные различия между LA и BN, а также между LA и HC в режимах положительной (+ESI) и отрицательной (−ESI) электроспрейной ионизации. Однако существенных различий между BN и HC в условиях +ESI и -ESI обнаружено не было.
Мы обнаружили 382 дифференциальных признака между LA и HC, 231 дифференциальный признак между LA и BN и 95 дифференциальных признаков между BN и HC (критерий знаковых рангов Вилкоксона, FDR <0,05 и множественное изменение >1,2 или <0,83) (рис. 1c-e). Пики были дополнительно аннотированы (дополнительные данные 3) по базе данных (библиотека mzCloud/HMDB/Chemspider) по значению m/z, времени удерживания и поиску масс-спектров фрагментации (подробности описаны в разделе «Методы») 22. Наконец, было идентифицировано 33 и 38 аннотированных метаболитов со значительными различиями в количестве для LA по сравнению с BN (рис. 1f и дополнительная таблица 2) и LA по сравнению с HC (дополнительный рисунок 3 и дополнительная таблица 2) соответственно. Напротив, в группах BN и HC было выявлено всего 3 метаболита со значительными различиями в количестве (дополнительная таблица 2), что согласуется с перекрытием между группами BN и HC в PLS-DA. Эти дифференциальные метаболиты охватывают широкий спектр биохимических веществ (дополнительный рисунок 4). В совокупности эти результаты демонстрируют значительные изменения в сывороточном метаболоме, отражающие злокачественную трансформацию рака легких на ранней стадии по сравнению с доброкачественными узлами в легких или здоровыми людьми. Между тем, сходство сывороточного метаболома BN и HC предполагает, что доброкачественные легочные узлы могут иметь много общих биологических характеристик со здоровыми людьми. Учитывая, что мутации гена рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) распространены в подтипе 23 аденокарциномы легких, мы стремились определить влияние драйверных мутаций на сывороточный метаболом. Затем мы проанализировали общий метаболомный профиль 72 случаев с статусом EGFR в группе аденокарциномы легких. Интересно, что в ходе анализа главных компонентов (PCA) мы обнаружили сопоставимые профили у пациентов с мутацией EGFR (n = 41) и пациентов с диким типом EGFR (n = 31) (дополнительный рисунок 5a). Однако мы выявили 7 метаболитов, содержание которых значительно изменилось у пациентов с мутацией EGFR по сравнению с пациентами с диким типом EGFR (t-критерий, p < 0,05 и изменение в 1,2 раза или < 0,83 раза) (дополнительный рисунок 5b). Большинство этих метаболитов (5 из 7) представляют собой ацилкарнитины, которые играют важную роль в путях окисления жирных кислот.
Как показано на схеме рабочего процесса на рисунке 2a, биомаркеры для классификации узлов были получены с использованием операторов наименьшего абсолютного сжатия и отбора на основе 33 дифференциальных метаболитов, идентифицированных в LA (n = 136) и BN (n = 170). Наилучшая комбинация переменных (LASSO) – модель бинарной логистической регрессии. Для проверки надежности модели использовалась десятикратная перекрестная валидация. Отбор переменных и регуляризация параметров корректируются с помощью штрафа максимизации правдоподобия с параметром λ24. Глобальный метаболомный анализ был дополнительно проведен независимо в группах внутренней валидации (n = 104) и внешней валидации (n = 111) для проверки эффективности классификации дискриминантной модели. В результате 27 метаболитов в наборе данных были идентифицированы как лучшая дискриминантная модель с наибольшим средним значением AUC (рис. 2b), среди которых 9 имели повышенную активность, а 18 – пониженную активность в LA по сравнению с BN (рис. 2c).
a) Схема построения классификатора легочных узлов, включающая выбор наилучшей панели сывороточных метаболитов в наборе данных для обнаружения с использованием бинарной логистической регрессионной модели посредством десятикратной перекрестной валидации и оценку прогностической эффективности во внутренних и внешних валидационных наборах данных. b) Статистика перекрестной валидации модели LASSO-регрессии для выбора метаболических биомаркеров. Приведенные выше числа представляют среднее количество биомаркеров, выбранных при заданном λ. Красная пунктирная линия представляет среднее значение AUC при соответствующем значении лямбда. Серые полосы погрешностей представляют минимальное и максимальное значения AUC. Пунктирная линия указывает на лучшую модель с 27 выбранными биомаркерами. AUC — площадь под кривой рабочей характеристики приемника (ROC). c) Кратность изменений 27 выбранных метаболитов в группе LA по сравнению с группой BN в группе обнаружения. Красный столбец — активация. Синий столбец — снижение. d–f Кривые рабочих характеристик приемника (ROC), демонстрирующие мощность дискриминантной модели на основе 27 комбинаций метаболитов в наборах данных для обнаружения, внутренней и внешней валидации. Исходные данные представлены в виде файлов исходных данных.
На основе взвешенных коэффициентов регрессии этих 27 метаболитов была создана прогностическая модель (дополнительная таблица 3). ROC-анализ на основе этих 27 метаболитов показал значение площади под кривой (AUC) 0,933, чувствительность в группе обнаружения составила 0,868, а специфичность — 0,859 (рис. 2d). Между тем, среди 38 аннотированных дифференциальных метаболитов между LA и HC, набор из 16 метаболитов достиг AUC 0,902 с чувствительностью 0,801 и специфичностью 0,856 при дифференциации LA от HC (дополнительный рисунок 6a-c). Также были сравнены значения AUC, основанные на различных пороговых значениях изменения кратности для дифференциальных метаболитов. Мы обнаружили, что модель классификации показала наилучшие результаты в различении LA и BN (HC) при уровне изменения в 1,2 раза по сравнению с 1,5 или 2,0 (дополнительный рисунок 7a,b). Модель классификации, основанная на 27 группах метаболитов, была дополнительно валидирована во внутренних и внешних когортах. AUC составила 0,915 (чувствительность 0,867, специфичность 0,811) для внутренней валидации и 0,945 (чувствительность 0,810, специфичность 0,979) для внешней валидации (рис. 2e, f). Для оценки межлабораторной эффективности 40 образцов из внешней когорты были проанализированы во внешней лаборатории, как описано в разделе «Методы». Точность классификации достигла AUC 0,925 (дополнительный рисунок 8). Поскольку плоскоклеточный рак легких (LUSC) является вторым по распространенности подтипом немелкоклеточного рака легких (NSCLC) после аденокарциномы легких (LUAD), мы также проверили подтвержденную потенциальную полезность метаболических профилей. BN и 16 случаев LUSC. AUC дискриминации между LUSC и BN составил 0,776 (дополнительный рисунок 9), что указывает на более низкую способность по сравнению с дискриминацией между LUAD и BN.
Исследования показали, что размер узлов на КТ-изображениях положительно коррелирует с вероятностью злокачественности и остается основным фактором, определяющим лечение узлов25,26,27. Анализ данных большой когорты скринингового исследования NELSON показал, что риск злокачественности у пациентов с узлами <5 мм был даже аналогичен риску у пациентов без узлов28. Поэтому минимальный размер, требующий регулярного КТ-мониторинга, составляет 5 мм, как рекомендует Британское торакальное общество (BTS), и 6 мм, как рекомендует Общество Флейшнера29. Однако узлы размером более 6 мм без явных доброкачественных признаков, называемые неопределенными легочными узлами (IPN), остаются серьезной проблемой при оценке и лечении в клинической практике30,31. Далее мы изучили, влияет ли размер узла на метаболомные сигнатуры, используя объединенные образцы из когорт обнаружения и внутренней валидации. Сосредоточившись на 27 валидированных биомаркерах, мы сначала сравнили профили PCA метаболомов HC и BN размером менее 6 мм. Мы обнаружили, что большинство точек данных для HC и BN перекрываются, демонстрируя сходство уровней метаболитов в сыворотке крови в обеих группах (рис. 3a). Карты признаков в разных диапазонах размеров оставались неизменными в BN и LA (рис. 3b, c), тогда как в диапазоне 6–20 мм наблюдалось разделение между злокачественными и доброкачественными узлами (рис. 3d). В этой когорте AUC составила 0,927, специфичность – 0,868, а чувствительность – 0,820 для прогнозирования злокачественности узлов размером от 6 до 20 мм (рис. 3e, f). Наши результаты показывают, что классификатор может выявлять метаболические изменения, вызванные ранней злокачественной трансформацией, независимо от размера узла.
ad Сравнение профилей PCA между указанными группами на основе метаболического классификатора из 27 метаболитов. CC и BN < 6 мм. b BN < 6 мм против BN 6–20 мм. в LA 6–20 мм против LA 20–30 мм. g BN 6–20 мм и LA 6–20 мм. GC, n = 174; BN < 6 мм, n = 153; BN 6–20 мм, n = 91; LA 6–20 мм, n = 89; LA 20–30 мм, n = 77. e Кривая рабочих характеристик приемника (ROC), показывающая эффективность дискриминантной модели для узлов 6–20 мм. f Значения вероятности были рассчитаны на основе модели логистической регрессии для узлов размером 6–20 мм. Серая пунктирная линия представляет оптимальное пороговое значение (0,455). Приведенные выше цифры представляют собой прогнозируемый процент случаев заболевания в Лос-Анджелесе. Используйте двухсторонний t-критерий Стьюдента. PCA — анализ главных компонентов. AUC — площадь под кривой. Исходные данные предоставлены в виде файлов исходных данных.
Для иллюстрации эффективности предложенной модели прогнозирования злокачественности были дополнительно отобраны четыре образца (возраст 44–61 год) со схожими размерами легочных узлов (7–9 мм) (рис. 4a, b). При первоначальном обследовании случай 1 представлял собой солидный узел с кальцификацией, признаком, ассоциирующимся со злокачественностью, тогда как случай 2 представлял собой неопределенный частично солидный узел без явных признаков доброкачественности. Три раунда контрольных КТ-сканирований показали, что эти случаи оставались стабильными в течение 4 лет и, следовательно, были расценены как доброкачественные узлы (рис. 4a). По сравнению с клинической оценкой серийных КТ-сканирований, однократный анализ метаболитов сыворотки с использованием текущей модели классификатора быстро и правильно идентифицировал эти доброкачественные узлы на основе вероятностных ограничений (табл. 1). На рисунке 4b в случае 3 показан узел с признаками плевральной ретракции, которая чаще всего ассоциируется со злокачественностью32. В случае 4 наблюдался неопределенный частично солидный узел без признаков доброкачественного происхождения. Все эти случаи были классифицированы как злокачественные согласно модели классификатора (таблица 1). Диагноз аденокарциномы легкого был подтвержден гистопатологическим исследованием после операции резекции легкого (рис. 4b). Для внешней валидационной выборки метаболический классификатор точно предсказал два случая неопределенных узлов в легких размером более 6 мм (дополнительный рисунок 10).
КТ-изображения легких в аксиальной проекции двух случаев доброкачественных узлов. В случае 1 КТ-сканирование через 4 года показало стабильный солидный узел размером 7 мм с кальцификацией в правом нижнем отделе легкого. В случае 2 КТ-сканирование через 5 лет выявило стабильный, частично солидный узел диаметром 7 мм в правом верхнем отделе легкого. b Аксиальные КТ-изображения легких и соответствующие патологические исследования двух случаев аденокарциномы I стадии до резекции легкого. В случае 3 выявлен узел диаметром 8 мм в правом верхнем отделе легкого с плевральной ретракцией. В случае 4 выявлен частично солидный узел типа «матового стекла» размером 9 мм в левом верхнем отделе легкого. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) резецированной легочной ткани (масштабная линейка = 50 мкм) демонстрирует ацинарный характер роста аденокарциномы легкого. Стрелками указаны узлы, обнаруженные на КТ-изображениях. Изображения, окрашенные гематоксилином и эозином, представляют собой репрезентативные изображения нескольких (>3) микроскопических полей, исследованных патологоанатомом.
В совокупности наши результаты демонстрируют потенциальную ценность биомаркеров метаболитов сыворотки крови в дифференциальной диагностике легочных узлов, что может создавать трудности при оценке эффективности КТ-скрининга.
На основе проверенной панели дифференциальных метаболитов мы стремились выявить биологические корреляты основных метаболических изменений. Анализ обогащения путей KEGG с помощью MetaboAnalyst выявил 6 общих значительно измененных путей между двумя заданными группами (LA против HC и LA против BN, скорректированное p ≤ 0,001, эффект > 0,01). Эти изменения характеризовались нарушениями метаболизма пирувата, метаболизма триптофана, метаболизма ниацина и никотинамида, гликолиза, цикла трикарбоновых кислот и метаболизма пуринов (рис. 5a). Затем мы дополнительно провели целевой метаболомный анализ для подтверждения основных изменений с использованием абсолютного количественного определения. Определение общих метаболитов в общих измененных путях проводилось методом тройной квадрупольной масс-спектрометрии (QQQ) с использованием аутентичных стандартов метаболитов. Демографические характеристики целевой выборки метаболомного исследования приведены в дополнительной таблице 4. В соответствии с нашими глобальными результатами метаболомного анализа, количественный анализ подтвердил, что уровни гипоксантина и ксантина, пирувата и лактата были повышены в группе LA по сравнению с группами BN и HC (рис. 5b, c, p <0,05). Однако существенных различий в уровнях этих метаболитов между группами BN и HC обнаружено не было.
Анализ обогащения метаболических путей KEGG для значимо различающихся метаболитов в группе LA по сравнению с группами BN и HC. Использовался двусторонний глобальный тест, а значения p корректировались с помощью метода Холма-Бонферрони (скорректированное p ≤ 0,001 и размер эффекта > 0,01). b–d Скрипичные диаграммы, показывающие уровни гипоксантина, ксантина, лактата, пирувата и триптофана в сыворотке HC, BN и LA, определенные методом ЖХ-МС/МС (n = 70 в каждой группе). Белые и черные пунктирные линии обозначают медиану и квартиль соответственно. e Скрипичная диаграмма, показывающая нормализованную экспрессию мРНК SLC7A5 и QPRT в аденокарциноме легких (n = 513) по сравнению с нормальной легочной тканью (n = 59) в наборе данных LUAD-TCGA. Белый прямоугольник представляет собой межквартильный размах, горизонтальная черная линия в центре представляет медиану, а вертикальная черная линия, исходящая из прямоугольника, представляет 95% доверительный интервал (ДИ). f. График корреляции Пирсона экспрессии SLC7A5 и GAPDH в аденокарциноме легких (n = 513) и нормальной ткани легких (n = 59) в наборе данных TCGA. Серая область представляет 95% ДИ. r, коэффициент корреляции Пирсона. g. Нормализованные уровни клеточного триптофана в клетках A549, трансфицированных неспецифическим контрольным shRNA (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), определенные методом LC-MS/MS. Представлен статистический анализ пяти биологически независимых образцов в каждой группе. h. Клеточные уровни NADt (общего NAD, включая NAD+ и NADH) в клетках A549 (NC) и клетках A549 с нокдауном SLC7A5 (Sh1, Sh2). Представлен статистический анализ трех биологически независимых образцов в каждой группе. i Гликолитическая активность клеток A549 до и после нокдауна SLC7A5 измерялась по скорости внеклеточного закисления (ECAR) (n = 4 биологически независимых образца на группу). 2-DG,2-дезокси-D-глюкоза. В (b–h) использовался двухсторонний t-критерий Стьюдента. В (g–i) полосы погрешностей представляют среднее значение ± стандартное отклонение, каждый эксперимент проводился трижды независимо, и результаты были схожими. Исходные данные представлены в виде файлов исходных данных.
Учитывая значительное влияние измененного метаболизма триптофана в группе LA, мы также оценили уровни триптофана в сыворотке крови в группах HC, BN и LA с помощью QQQ. Мы обнаружили, что уровень триптофана в сыворотке крови был снижен в группе LA по сравнению с группами HC или BN (p < 0,001, рисунок 5d), что согласуется с предыдущими данными о том, что уровни циркулирующего триптофана ниже у пациентов с раком легких, чем у здоровых людей из контрольной группы33,34,35. Другое исследование с использованием ПЭТ/КТ-трассера 11C-метил-L-триптофана показало, что время удержания сигнала триптофана в ткани рака легких было значительно увеличено по сравнению с доброкачественными поражениями или нормальной тканью36. Мы предполагаем, что снижение уровня триптофана в сыворотке крови группы LA может отражать активное поглощение триптофана клетками рака легких.
Известно также, что конечным продуктом кинуренинового пути катаболизма триптофана является NAD+37,38, который является важным субстратом для реакции глицеральдегид-3-фосфата с 1,3-бисфосфоглицератом в гликолизе39. В то время как предыдущие исследования были сосредоточены на роли катаболизма триптофана в регуляции иммунитета, мы стремились выяснить взаимодействие между нарушением регуляции триптофана и гликолитическими путями, наблюдаемое в данном исследовании. Известно, что белок семейства транспортеров растворенных веществ 7, член 5 (SLC7A5), является транспортером триптофана43,44,45. Хинолиновая кислота фосфорибозилтрансфераза (QPRT) — это фермент, расположенный ниже по течению кинуренинового пути, который превращает хинолиновую кислоту в NAMN46. Анализ набора данных LUAD TCGA показал, что экспрессия SLC7A5 и QPRT была значительно повышена в опухолевой ткани по сравнению с нормальной тканью (рис. 5e). Это повышение наблюдалось на стадиях I и II, а также на стадиях III и IV аденокарциномы легких (дополнительный рисунок 11), что указывает на ранние нарушения метаболизма триптофана, связанные с канцерогенезом.
Кроме того, набор данных LUAD-TCGA показал положительную корреляцию между экспрессией мРНК SLC7A5 и GAPDH в образцах пациентов с раком (r = 0,45, p = 1,55E-26, рисунок 5f). В отличие от этого, значимой корреляции между такими генными сигнатурами в нормальной легочной ткани обнаружено не было (r = 0,25, p = 0,06, рисунок 5f). Нокдаун SLC7A5 (дополнительный рисунок 12) в клетках A549 значительно снизил клеточные уровни триптофана и NAD(H) (рисунок 5g,h), что привело к ослаблению гликолитической активности, измеренной по скорости внеклеточного закисления (ECAR) (рисунок 1). 5i). Таким образом, основываясь на метаболических изменениях в сыворотке и результатах исследований in vitro, мы предполагаем, что метаболизм триптофана может продуцировать NAD+ через кинурениновый путь и играть важную роль в стимулировании гликолиза при раке легких.
Исследования показали, что большое количество неопределенных легочных узлов, выявленных с помощью низкодозовой компьютерной томографии (НДКТ), может привести к необходимости дополнительных исследований, таких как ПЭТ-КТ, биопсия легких, и к избыточному лечению из-за ложноположительного диагноза злокачественного новообразования.31 Как показано на рисунке 6, в нашем исследовании была выявлена панель сывороточных метаболитов, обладающих потенциальной диагностической ценностью, которая может улучшить стратификацию риска и последующее ведение пациентов с легочными узлами, выявленными с помощью КТ.
Легочные узлы оцениваются с помощью низкодозовой компьютерной томографии (НДКТ) с визуализационными признаками, указывающими на доброкачественное или злокачественное происхождение. Неопределенный исход при наличии узлов может приводить к частым контрольным визитам, ненужным вмешательствам и чрезмерному лечению. Включение диагностически значимых метаболических классификаторов сыворотки крови может улучшить оценку риска и последующее ведение пациентов с легочными узлами. ПЭТ-позитронно-эмиссионная томография.
Данные американского исследования NLST и европейского исследования NELSON свидетельствуют о том, что скрининг групп высокого риска с помощью низкодозовой компьютерной томографии (НДКТ) может снизить смертность от рака легких1,3. Однако оценка риска и последующее клиническое ведение большого количества случайно обнаруженных легочных узлов, выявленных с помощью НДКТ, остаются наиболее сложной задачей. Главная цель — оптимизировать правильную классификацию существующих протоколов на основе НДКТ путем включения надежных биомаркеров.
Некоторые молекулярные биомаркеры, такие как метаболиты крови, были идентифицированы путем сравнения рака легких со здоровыми контрольными группами15,17. В данном исследовании мы сосредоточились на применении анализа метаболомики сыворотки для различения доброкачественных и злокачественных легочных узлов, случайно обнаруженных при низкодозовой компьютерной томографии (НДКТ). Мы сравнили глобальный метаболом сыворотки здоровых контрольных образцов (HC), образцов доброкачественных легочных узлов (BN) и образцов аденокарциномы легких I стадии (LA) с использованием анализа UPLC-HRMS. Мы обнаружили, что HC и BN имеют схожие метаболические профили, тогда как LA демонстрирует значительные изменения по сравнению с HC и BN. Мы идентифицировали два набора метаболитов сыворотки, которые позволяют дифференцировать LA от HC и BN.
Современная схема идентификации доброкачественных и злокачественных узлов на основе низкодозовой компьютерной томографии (НДКТ) в основном базируется на размере, плотности, морфологии и скорости роста узлов с течением времени30. Предыдущие исследования показали, что размер узлов тесно связан с вероятностью развития рака легких. Даже у пациентов высокого риска риск злокачественности узлов размером <6 мм составляет <1%. Риск злокачественности узлов размером от 6 до 20 мм колеблется от 8% до 64%30. Поэтому Общество Флейшнера рекомендует пороговый диаметр 6 мм для рутинного КТ-наблюдения.29 Однако оценка риска и ведение пациентов с неопределенными легочными узлами (НПУ) размером более 6 мм не были адекватно проведены31. Современное лечение врожденных пороков сердца обычно основано на выжидательной тактике с частым КТ-мониторингом.
На основе валидированного метаболома мы впервые продемонстрировали совпадение метаболомных сигнатур между здоровыми людьми и доброкачественными узлами размером <6 мм. Биологическое сходство согласуется с предыдущими данными КТ, согласно которым риск злокачественности для узлов <6 мм так же низок, как и для лиц без узлов.30 Следует отметить, что наши результаты также демонстрируют высокое сходство метаболомных профилей доброкачественных узлов <6 мм и ≥6 мм, что предполагает, что функциональное определение доброкачественной этиологии является согласованным независимо от размера узла. Таким образом, современные диагностические панели сывороточных метаболитов могут обеспечить единый анализ в качестве теста для исключения диагноза при первоначальном обнаружении узлов на КТ и потенциально сократить серийное наблюдение. В то же время, та же панель метаболических биомаркеров позволила отличить злокачественные узлы размером ≥6 мм от доброкачественных узлов и обеспечить точные прогнозы для интраперитонеальных узлов аналогичного размера и с неоднозначными морфологическими признаками на изображениях КТ. Этот классификатор метаболизма сыворотки показал хорошие результаты в прогнозировании злокачественности узлов размером ≥6 мм с AUC 0,927. В совокупности наши результаты указывают на то, что уникальные метаболомные сигнатуры сыворотки могут специфически отражать ранние метаболические изменения, вызванные опухолью, и имеют потенциальную ценность в качестве предикторов риска, независимо от размера узла.
Следует отметить, что аденокарцинома легких (LUAD) и плоскоклеточная карцинома легких (LUSC) являются основными типами немелкоклеточного рака легких (NSCLC). Учитывая, что LUSC тесно связана с употреблением табака47, а LUAD является наиболее распространенным гистологическим типом случайно обнаруженных узлов в легких при КТ-скрининге48, наша модель классификации была специально разработана для образцов аденокарциномы I стадии. Ван и его коллеги также сосредоточились на LUAD и выявили девять липидных сигнатур с использованием липидомики для различения рака легких на ранней стадии от здоровых людей17. Мы протестировали существующую модель классификации на 16 случаях LUSC I стадии и 74 доброкачественных узлах и наблюдали низкую точность прогнозирования LUSC (AUC 0,776), что предполагает, что LUAD и LUSC могут иметь свои собственные метаболомные сигнатуры. Действительно, было показано, что LUAD и LUSC различаются по этиологии, биологическому происхождению и генетическим аберрациям49. Следовательно, в обучающие модели для выявления рака легких на популяционном уровне в рамках скрининговых программ следует включать и другие типы гистологии.
В данном исследовании мы выявили шесть наиболее часто изменяющихся метаболических путей при аденокарциноме легких по сравнению со здоровыми контрольными группами и доброкачественными узлами. Ксантин и гипоксантин являются распространенными метаболитами пуринового метаболического пути. В соответствии с нашими результатами, промежуточные соединения, связанные с пуриновым метаболизмом, были значительно повышены в сыворотке или тканях пациентов с аденокарциномой легких по сравнению со здоровыми контрольными группами или пациентами на преинвазивной стадии15,50. Повышенные уровни ксантина и гипоксантина в сыворотке могут отражать анаболизм, необходимый для быстро пролиферирующих раковых клеток. Нарушение метаболизма глюкозы является хорошо известным признаком метаболизма рака51. Здесь мы наблюдали значительное увеличение пирувата и лактата в группе LA по сравнению с группами HC и BN, что согласуется с предыдущими сообщениями о нарушениях гликолитического пути в профилях метаболома сыворотки пациентов с немелкоклеточным раком легких (НМРЛ) и здоровых контрольных групп. Результаты согласуются52,53.
Важно отметить, что мы наблюдали обратную корреляцию между метаболизмом пирувата и триптофана в сыворотке крови пациентов с аденокарциномой легких. Уровни триптофана в сыворотке крови были снижены в группе LA по сравнению с группами HC или BN. Интересно, что предыдущее крупномасштабное исследование с использованием проспективной когорты показало, что низкие уровни циркулирующего триптофана связаны с повышенным риском рака легких 54. Триптофан — это незаменимая аминокислота, которую мы получаем исключительно из пищи. Мы заключаем, что истощение триптофана в сыворотке крови при аденокарциноме легких может отражать быстрое истощение этого метаболита. Хорошо известно, что конечным продуктом катаболизма триптофана по кинурениновому пути является источник синтеза NAD+ de novo. Поскольку NAD+ образуется в основном через путь реутилизации, значение NAD+ в метаболизме триптофана в условиях здоровья и болезни еще предстоит определить46. Наш анализ базы данных TCGA показал, что экспрессия транспортера триптофана 7A5 (SLC7A5) значительно повышена при аденокарциноме легких по сравнению с нормальными контрольными образцами и положительно коррелирует с экспрессией гликолитического фермента GAPDH. Предыдущие исследования в основном были сосредоточены на роли катаболизма триптофана в подавлении противоопухолевого иммунного ответа40,41,42. Здесь мы демонстрируем, что ингибирование поглощения триптофана путем нокдауна SLC7A5 в клетках рака легких приводит к последующему снижению уровня клеточного НАД и сопутствующему ослаблению гликолитической активности. В заключение, наше исследование предоставляет биологическую основу для изменений в метаболизме сыворотки, связанных со злокачественной трансформацией аденокарциномы легких.
Мутации EGFR являются наиболее распространенными драйверными мутациями у пациентов с НМРЛ. В нашем исследовании мы обнаружили, что у пациентов с мутацией EGFR (n = 41) общий метаболомный профиль был аналогичен профилю пациентов с EGFR дикого типа (n = 31), хотя мы обнаружили снижение уровня ацилкарнитина в сыворотке крови у некоторых пациентов с мутацией EGFR. Установленная функция ацилкарнитина заключается в транспортировке ацильных групп из цитоплазмы в митохондриальный матрикс, что приводит к окислению жирных кислот для выработки энергии 55. В соответствии с нашими результатами, недавнее исследование также выявило сходные метаболомные профили между опухолями с мутацией EGFR и опухолями с EGFR дикого типа путем анализа глобального метаболома 102 образцов ткани аденокарциномы легких50. Интересно, что содержание ацилкарнитина также было обнаружено в группе с мутацией EGFR. Таким образом, вопрос о том, отражают ли изменения уровня ацилкарнитина метаболические изменения, вызванные EGFR, и лежащие в их основе молекулярные механизмы, заслуживает дальнейшего изучения.
В заключение, наше исследование разработало классификатор метаболизма сыворотки крови для дифференциальной диагностики легочных узлов и предложило алгоритм действий, который может оптимизировать оценку риска и облегчить клиническое ведение пациентов на основе скрининга с помощью компьютерной томографии.
Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Онкологической больницы Университета Сунь Ятсена, Первой аффилированной больницы Университета Сунь Ятсена и Комитетом по этике Онкологической больницы Университета Чжэнчжоу. В группах обнаружения и внутренней валидации были собраны 174 образца сыворотки крови здоровых людей и 244 образца сыворотки крови пациентов с доброкачественными узлами, проходивших ежегодные медицинские осмотры в Отделении контроля и профилактики рака Онкологического центра Университета Сунь Ятсена, а также 166 образцов сыворотки крови пациентов с доброкачественными узлами. Образцы сыворотки крови пациентов с аденокарциномой легких I стадии были собраны в Онкологическом центре Университета Сунь Ятсена. Во внешней валидационной когорте было 48 случаев доброкачественных узлов, 39 случаев аденокарциномы легких I стадии из Первой аффилированной больницы Университета Сунь Ятсена и 24 случая аденокарциномы легких I стадии из Онкологической больницы Чжэнчжоу. Онкологический центр Университета Сунь Ятсена также собрал 16 случаев плоскоклеточного рака легких I стадии для проверки диагностической способности установленного метаболического классификатора (характеристики пациентов представлены в дополнительной таблице 5). Образцы из исследовательской когорты и внутренней валидационной когорты были собраны в период с января 2018 года по май 2020 года. Образцы для внешней валидационной когорты были собраны в период с августа 2021 года по октябрь 2022 года. Для минимизации гендерного смещения в каждую когорту было включено приблизительно равное количество случаев мужского и женского пола. Исследовательская группа и Внутренняя группа по проверке. Пол участников определялся на основе самоотчета. От всех участников было получено информированное согласие, компенсация не предоставлялась. К субъектам с доброкачественными узлами относились те, у кого показатель КТ-сканирования оставался стабильным в течение 2–5 лет на момент анализа, за исключением 1 случая из внешней валидационной выборки, который был собран предоперационно и диагностирован гистопатологией. За исключением хронического бронхита. Образцы аденокарциномы легких были собраны до резекции легкого и подтверждены патологическим диагнозом. Образцы крови натощак собирали в пробирки для разделения сыворотки без каких-либо антикоагулянтов. Образцы крови свертывали в течение 1 часа при комнатной температуре, а затем центрифугировали при 2851 × g в течение 10 минут при 4°C для получения супернатанта сыворотки. Аликвоты сыворотки замораживали при -80°C до экстракции метаболитов. Отдел профилактики рака и медицинского обследования Онкологического центра Университета Сунь Ятсена собрал пул сыворотки от 100 здоровых доноров, включая равное количество мужчин и женщин в возрасте от 40 до 55 лет. Равные объемы образцов каждого донора смешивали, полученный пул разливали по аликвотам и хранили при -80°C. Смесь сыворотки использовали в качестве эталонного материала для контроля качества и стандартизации данных.
Референтные образцы сыворотки и исследуемые образцы были разморожены, а метаболиты экстрагированы с использованием комбинированного метода экстракции (МТБЭ/метанол/вода) 56. Вкратце, 50 мкл сыворотки смешивали с 225 мкл ледяного метанола и 750 мкл ледяного метил-трет-бутилового эфира (МТБЭ). Смесь перемешивали и инкубировали на льду в течение 1 часа. Затем образцы смешивали и перемешивали на вихревом смесителе с 188 мкл воды для масс-спектрометрии, содержащей внутренние стандарты (13C-лактат, 13C3-пируват, 13C-метионин и 13C6-изолейцин, приобретенные в Cambridge Isotope Laboratories). Затем смесь центрифугировали при 15 000 × g в течение 10 мин при 4 °C, а нижнюю фазу переносили в две пробирки (по 125 мкл каждая) для анализа методом ЖХ-МС в положительном и отрицательном режимах. Наконец, образец выпаривали досуха в высокоскоростном вакуумном концентраторе.
Высушенные метаболиты растворяли в 120 мкл 80% ацетонитрила, перемешивали на вихревом смесителе в течение 5 мин и центрифугировали при 15 000 × g в течение 10 мин при 4°C. Надосадочную жидкость переносили в янтарные стеклянные флаконы с микровставками для метаболомных исследований. Нецелевой метаболомный анализ проводили на платформе высокоэффективной жидкостной хроматографии-масс-спектрометрии высокого разрешения (UPLC-HRMS). Разделение метаболитов осуществляли с помощью системы Dionex Ultimate 3000 UPLC и колонки ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters). В режиме положительных ионов подвижными фазами были 95% (A) и 50% ацетонитрила (B), каждая из которых содержала 10 ммоль/л ацетата аммония и 0,1% муравьиной кислоты. В отрицательном режиме подвижные фазы А и В содержали 95% и 50% ацетонитрила соответственно, обе фазы содержали 10 ммоль/л ацетата аммония, pH = 9. Градиентная программа была следующей: 0–0,5 мин, 2% В; 0,5–12 мин, 2–50% В; 12–14 мин, 50–98% В; 14–16 мин, 98% В; 16–16,1 мин, 98–2% В; 16,1–20 мин, 2% В. Температура колонки поддерживалась на уровне 40°C, а образца в автосамплере — на уровне 10°C. Скорость потока составляла 0,3 мл/мин, объем инъекции — 3 мкл. Масс-спектрометр Q-Exactive Orbitrap (Thermo Fisher Scientific) с источником электрораспылительной ионизации (ESI) работал в режиме полного сканирования и был сопряжен с режимом мониторинга ddMS2 для сбора больших объемов данных. Параметры масс-спектрометра были установлены следующим образом: напряжение распыления +3,8 кВ/- 3,2 кВ, температура капилляра 320°C, защитный газ 40 ат. л., вспомогательный газ 10 ат. л., температура нагревателя зонда 350°C, диапазон сканирования 70–1050 м/ч, разрешение 70 000. Данные были получены с помощью программы Xcalibur 4.1 (Thermo Fisher Scientific).
Для оценки качества данных были созданы объединенные образцы контроля качества (КК) путем отбора аликвот по 10 мкл супернатанта из каждого образца. В начале аналитической последовательности было проанализировано шесть инъекций образцов контроля качества для оценки стабильности системы UPLC-MS. Затем образцы контроля качества периодически добавлялись в партию. Все 11 партий образцов сыворотки в этом исследовании были проанализированы методом ЖХ-МС. Аликвоты смеси объединенных образцов сыворотки от 100 здоровых доноров использовались в качестве эталонного материала в соответствующих партиях для контроля процесса экстракции и корректировки эффектов, связанных с партиями. Нецелевой метаболомный анализ когорты обнаружения, внутренней валидационной когорты и внешней валидационной когорты был проведен в Центре метаболомики Университета Сунь Ятсена. Внешняя лаборатория Центра анализа и тестирования Гуандунского технологического университета также проанализировала 40 образцов из внешней когорты для проверки эффективности модели классификатора.
После экстракции и восстановления абсолютное количественное определение метаболитов сыворотки проводилось с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии-тандемной масс-спектрометрии (Agilent 6495 тройной квадрупольный масс-спектрометр) с источником электрораспылительной ионизации (ESI) в режиме мониторинга множественных реакций (MRM). Для разделения метаболитов использовалась колонка ACQUITY BEH Amide (2,1 × 100 мм, 1,7 мкм, Waters). Подвижная фаза состояла из 90% (A) и 5% ацетонитрила (B) с 10 ммоль/л ацетата аммония и 0,1% раствором аммиака. Градиентная программа была следующей: 0–1,5 мин, 0% B; 1,5–6,5 мин, 0–15% B; 6,5–8 мин, 15% B; 8–8,5 мин, 15%–0% B; 8,5–11,5 мин, 0% B. Температура колонки поддерживалась на уровне 40 °C, а образца — на уровне 10 °C в автосамплере. Скорость потока составляла 0,3 мл/мин, а объем инъекции — 1 мкл. Параметры масс-спектрометра были установлены следующим образом: напряжение капилляра ±3,5 кВ, давление распылителя 35 psi, поток газа-носителя 12 л/мин, температура газа-носителя 350 °C, температура осушающего газа 250 °C и поток осушающего газа 14 л/мин. Коэффициенты конверсии MRM для триптофана, пирувата, лактата, гипоксантина и ксантина составляли 205,0–187,9, 87,0–43,4, 89,0–43,3, 135,0–92,3 и 151,0–107,9 соответственно. Данные собирались с помощью Mass Hunter B.07.00 (Agilent Technologies). В образцах сыворотки содержание триптофана, пирувата, лактата, гипоксантина и ксантина определяли с помощью калибровочных кривых стандартных растворов смесей. В образцах клеток содержание триптофана нормировали по внутреннему стандарту и массе клеточного белка.
Извлечение пиков (m/z и время удерживания (RT)) проводилось с использованием программ Compound Discovery 3.1 и TraceFinder 4.0 (Thermo Fisher Scientific). Для устранения потенциальных различий между партиями каждый характерный пик исследуемого образца делился на характерный пик эталонного материала из той же партии для получения относительной распространенности. Относительные стандартные отклонения внутренних стандартов до и после стандартизации показаны в дополнительной таблице 6. Различия между двумя группами характеризовались частотой ложных срабатываний (FDR<0,05, критерий знаковых рангов Вилкоксона) и изменением в кратности (>1,2 или <0,83). Необработанные данные MS извлеченных характеристик и данные MS, скорректированные с учетом эталонной сыворотки, показаны в дополнительных данных 1 и 2 соответственно. Аннотация пиков проводилась на основе четырех определенных уровней идентификации, включая идентифицированные метаболиты, предположительно аннотированные соединения, предположительно охарактеризованные классы соединений и неизвестные соединения 22. На основе поиска в базах данных Compound Discovery 3.1 (mzCloud, HMDB, Chemspider) в качестве промежуточных соединений между дифференциальным метаболомом были выбраны биологические соединения, соответствующие MS/MS проверенных стандартов или имеющие точные аннотации в mzCloud (оценка > 85) или Chemspider. Аннотации пиков для каждой характеристики включены в Дополнительные данные 3. Для одномерного анализа суммарной нормализованной распространенности метаболитов использовался MetaboAnalyst 5.0. MetaboAnalyst 5.0 также оценивал анализ обогащения путей KEGG на основе значительно различающихся метаболитов. Анализ главных компонентов (PCA) и дискриминантный анализ методом частичных наименьших квадратов (PLS-DA) проводились с использованием программного пакета ropls (v.1.26.4) с нормализацией стека и автомасштабированием. Оптимальная модель метаболического биомаркера для прогнозирования злокачественности узлов была построена с использованием бинарной логистической регрессии с оператором наименьшего абсолютного сжатия и отбора (LASSO, пакет R v.4.1-3). Эффективность дискриминантной модели в наборах данных для обнаружения и валидации была оценена путем оценки AUC на основе ROC-анализа с использованием пакета pROC (v.1.18.0). Оптимальный пороговый уровень вероятности был получен на основе максимального индекса Юдена модели (чувствительность + специфичность – 1). Образцы со значениями меньше или больше порогового значения будут прогнозироваться как доброкачественные узлы и аденокарцинома легких соответственно.
Клетки A549 (#CCL-185, Американская коллекция типовых культур) выращивали в среде F-12K, содержащей 10% FBS. Последовательности коротких шпилечных РНК (shRNA), нацеленных на SLC7A5, и контрольный нецелевой вариант (NC) были вставлены в лентивирусный вектор pLKO.1-puro. Антисмысловые последовательности shSLC7A5 следующие: Sh1 (5′-GGAGAAACCTGATGAACAGTT-3′), Sh2 (5′-GCCGTGGACTTCGGGAACTAT-3′). Антитела к SLC7A5 (#5347) и тубулину (#2148) были приобретены у компании Cell Signaling Technology. Антитела к SLC7A5 и тубулину использовали в разведении 1:1000 для вестерн-блоттинга.
Тест на гликолитический стресс Seahorse XF измеряет уровни внеклеточной закисленности (ECAR). В ходе анализа последовательно вводили глюкозу, олигомицин А и 2-DG для проверки клеточной гликолитической способности, измеряемой по показателю ECAR.
Клетки A549, трансфицированные нецелевым контрольным белком (NC) и shSLC7A5 (Sh1, Sh2), высевали на ночь в чашки Петри диаметром 10 см. Метаболиты клеток экстрагировали 1 мл ледяного 80% водного метанола. Клетки в метанольном растворе соскабливали, собирали в новую пробирку и центрифугировали при 15 000 × g в течение 15 мин при 4°C. Собирали 800 мкл супернатанта и высушивали с помощью высокоскоростного вакуумного концентратора. Затем высушенные осадки метаболитов анализировали на содержание триптофана с помощью LC-MS/MS, как описано выше. Уровни клеточного NAD(H) в клетках A549 (NC и shSLC7A5) измеряли с помощью количественного колориметрического набора NAD+/NADH (#K337, BioVision) в соответствии с инструкциями производителя. Для каждого образца измеряли уровни белка для нормализации количества метаболитов.
Для предварительного определения размера выборки статистические методы не использовались. Предыдущие метаболомические исследования, направленные на поиск биомаркеров15,18, рассматривались как эталоны для определения размера выборки, и по сравнению с этими отчетами наша выборка оказалась достаточной. Из когорты исследования не было исключено ни одного образца. Образцы сыворотки были случайным образом распределены в группу поиска (306 случаев, 74,6%) и группу внутренней валидации (104 случая, 25,4%) для нецелевых метаболомических исследований. Мы также случайным образом отобрали по 70 случаев из каждой группы из набора для поиска для целевых метаболомических исследований. Исследователи не знали о принадлежности к группам во время сбора и анализа данных LC-MS. Статистический анализ метаболомических данных и клеточных экспериментов описан в соответствующих разделах «Результаты», «Подписи к рисункам» и «Методы». Количественное определение клеточного триптофана, NADT и гликолитической активности проводилось трижды независимо с идентичными результатами.
Более подробную информацию о методологии исследования см. в аннотации к отчету Natural Portfolio Report Abstract, прилагаемому к данной статье.
Исходные данные масс-спектрометрии (МС) извлеченных признаков и нормализованные данные МС референсной сыворотки представлены в Дополнительных данных 1 и Дополнительных данных 2 соответственно. Аннотации пиков для дифференциальных признаков представлены в Дополнительных данных 3. Набор данных LUAD TCGA можно загрузить с сайта https://portal.gdc.cancer.gov/. Входные данные для построения графика приведены в исходных данных. Исходные данные предоставлены для данной статьи.
Национальная исследовательская группа по скринингу рака легких и др. Снижение смертности от рака легких с помощью низкодозовой компьютерной томографии. Северная Англия. Журнал медицины 365, 395–409 (2011).
Крамер, Б.С., Берг, К.Д., Аберле, Д.Р. и Профет, П.К. Скрининг рака легких с использованием низкодозовой спиральной компьютерной томографии: результаты Национального исследования скрининга легких (NLST). J. Med. Screen 18, 109–111 (2011).
Де Конинг, Х. Дж. и др. Снижение смертности от рака легких с помощью объемной КТ-диагностики в рандомизированном исследовании. Северная Англия. Журнал медицины 382, 503–513 (2020).
Дата публикации: 18 сентября 2023 г.