Система CRISPR (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats) — это метод редактирования генома третьего поколения, который произвел революцию в мире благодаря своим высокопроизводительным результатам. Она используется для лечения различных биологических заболеваний и инфекций. Различные бактерии и другие прокариоты (например, археи) также имеют системы CRISPR/Cas9 для защиты от фагов. Сообщается, что стратегии на основе CRISPR/Cas9 могут ингибировать рост и прогрессирование тройного негативного рака молочной железы (ТНБК) путем воздействия на потенциально измененные гены резистентности, транскрипцию и эпигенетическую регуляцию. Эти терапевтические вмешательства могут помочь решить сложные проблемы, такие как лекарственная устойчивость, наблюдаемая даже при ТНБК. В настоящее время для доставки CRISPR/Cas9 в целевые клетки используются различные методы, такие как физические (микроинъекция, электропорация и гидродинамические режимы), вирусные (аденоассоциированный вирус и лентивирус) и невирусные (липосомы и липидные наночастицы). Несмотря на то, что были разработаны различные модели для изучения молекулярных причин трижды негативного рака молочной железы (ТНБК), отсутствие чувствительных и целенаправленных методов доставки инструментов редактирования генома in vivo ограничивает их клиническое применение. В заключение, этот обзор всесторонне рассматривает прогресс, проблемы, ограничения и перспективы лечения ТНБК с помощью CRISPR/Cas9 на основе имеющихся данных. Мы также подчеркиваем, как сочетание искусственного интеллекта и машинного обучения может улучшить стратегии CRISPR/Cas9 в лечении ТНБК.
Рак характеризуется неконтролируемым делением клеток, нарушением контрольных точек клеточного цикла и мутациями в генах-супрессорах опухолей (TSG) (Matthews et al., 2022). Среди различных типов рака рак молочной железы является наиболее распространенным типом рака у женщин и имеет высокий уровень смертности во всем мире (Waks and Winer, 2019). Рак молочной железы — это гетерогенное заболевание с разнообразными характеристиками, такими как гистологические и биологические особенности, клиническая картина и поведение, а также ответ на лечение (Weigelt et al., 2010). Классификация рака молочной железы дает точное представление о диагностике рака молочной железы и прогнозе опухоли. Использование общих биомаркеров и клинико-патологических признаков является основным критерием классификации рака молочной железы (Tsang and Tse, 2019). Прогноз и ответ на лечение рака молочной железы зависят от множества факторов, включая наличие рецепторов эстрогена (ER), рецепторов прогестерона (PR), рецептора эпидермального фактора роста человека 2 (HER2/neu), а также гистологическую степень злокачественности, тип и размер опухоли, и наличие метастазов в лимфатические узлы (Al-Tubaiti, 2020). Было выявлено пять внутренних молекулярных подтипов рака молочной железы, включая люминальный А, люминальный В, HER2-обогащенный, базальноподобный и клаудин-низкий (Prat et al., 2015). Тройно-негативный рак молочной железы (ТНБК) — это молекулярный подтип рака, который не экспрессирует все ER, PR и HER2 (Yin et al., 2020). Эти патологические особенности связаны с ТНБК, подтверждая его быстрое прогрессирование и более агрессивный характер, чем любой другой тип рака молочной железы (Feng et al., 2018). Кроме того, Перу и др. (2000) использовали технологию микроматриц для переклассификации рака молочной железы и выявления пяти внутренних подтипов рака молочной железы (Каденас, 2012). Базально-подобный рак молочной железы — это подтип рака молочной железы, имеющий тройной негативный фенотип и связанный с быстрым прогрессированием. Следует отметить, что все базально-подобные раки молочной железы часто ошибочно диагностируются как тройной негативный рак молочной железы (ТНБК), но только 77% из них являются ТНБК; напротив, 71–91% ТНБК являются базально-подобными, что указывает на перекрытие этих двух типов рака молочной железы и представление различных классификаций (Ван Д.-Ю. и др., 2019). Это создает необходимость охарактеризовать гетерогенность ТНБК для уточнения прогноза и выявления потенциальных ответов на существующие и будущие методы лечения. Кроме того, на ТНБК приходится 15–20% всех случаев рака молочной железы, и он чаще встречается у женщин моложе 50 лет. Мутации генов BRCA1 или BRCA2 были обнаружены примерно в 20% случаев трижды негативного рака молочной железы (ТНБК) (Xie et al., 2017; Tzikas et al., 2017, 2020). Исследования также показали, что ТНБК имеет особую иммунную микросреду, включающую высокие уровни факторов роста эндотелия сосудов, ассоциированных с опухолью макрофагов (TAM), опухолеинфильтрирующих лимфоцитов (TIL) и других молекул, участвующих в росте и миграции опухоли. Поэтому понимание микросреды ТНБК имеет решающее значение для прогноза и лечения этого заболевания (Fan and He, 2022).
Для оценки прогноза трижды негативного рака молочной железы (ТНБК) и обеспечения эффективного лечения важна точная диагностика, в основном основанная на иммуногистохимическом исследовании (ИГХ) для выявления рецепторов эстрогена (ER), прогестерона (PR) и HER2, а также маммографии для выявления новообразований молочной железы. Однако маммография не может адекватно отображать внутриопухолевые признаки, такие как некроз и фиброз (Deepak Singh et al., 2021). Поскольку плохой прогноз и неудовлетворительная диагностика не позволяют врачам назначать правильные лекарства (Chaudhary, 2020), используются различные стратегии для улучшения ухода за пациентами с ТНБК. В настоящее время у пациентов с ТНБК используются два препарата: доксорубицин и циклофосфамид, которые показали хорошие результаты. Кроме того, используются и другие препараты платины, такие как карбоплатин и цисплатин (Sikov et al., 2015). Кроме того, ингибиторы PARP, такие как олапариб, велапариб и PF-01367338, используются в качестве потенциальных химиотерапевтических препаратов для лечения ТНБК (Ishino et al., 2018). Поскольку было показано, что сигнальные пути Wnt/b-катенин, NOTCH и Hedgehog участвуют в возникновении и прогрессировании ТНБК, воздействие лекарственных препаратов на эти пути может стать важной стратегией (Aysola et al., 2013). Хотя хирургическое вмешательство, лучевая терапия и химиотерапия остаются основными методами лечения ТНБК сегодня, достигнут значительный прогресс в разработке новых методов лечения, включая таргетную терапию, иммунотерапию, различные инструменты редактирования генов, связанные с CRISPR, такие как Cas9n, dCas9, CRISPR/Cas12, прайм-редактирование и таргетную генную терапию с использованием CRISPR/Cas9. Здесь мы сосредоточимся на различных инструментах редактирования генов, связанных с CRISPR, используемых в лечении ТНБК. Среди них особое внимание привлекла система CRISPR/Cas9.
Cas9n, также известный как Cas9-никаза, представляет собой генетически модифицированный вариант белка Cas9, полученный с помощью системы редактирования генома CRISPR/Cas9 (Gupta et al., 2019). В своей первоначальной форме белок Cas9 содержит два нуклеазных домена: RuvC и HNH, основная функция которых заключается в расщеплении обеих нитей ДНК. Однако в Cas9n один из нуклеазных доменов, HNH, генетически мутирован и становится неактивным. Следовательно, домен HNH Cas9n остается нефункциональным. Активным остается только домен RuvC, позволяющий Cas9n разрезать или создавать разрывы на отдельных нитях ДНК (Trevino and Zhang, 2014). По сравнению с Cas9, Cas9n может эффективно снижать побочные эффекты и точно улучшать механизмы клеточной репарации. Cas9n может использоваться для решения различных задач, таких как создание разрывов в определенных местах двухцепочечной ДНК. Для этой цели были объединены и использованы две молекулы Cas9n (Yee, 2016). Киназа смешанной линии 3 (MLK3) — это митоген-активируемая протеинкиназа, которая служит ключевым регулятором во время метастазирования TNBC (Cronan et al., 2012).
MLK3 может активировать множество сигнальных путей, ведущих к метастазированию TNBC. Например, путь c-Jun N-концевой киназы (JNK) регулирует подвижность клеток и деградацию внеклеточного матрикса, а MLK3 активирует путь JNK, тем самым усиливая подвижность клеток и придавая им инвазивные свойства (Rattanasinchai и Gallo, 2016). MLK3 также регулирует ЭПТ. Для этого он активирует нижележащие транскрипционные факторы, такие как Snail, Slug и Twist. Эти факторы ингибируют экспрессию эпителиальных маркеров и способствуют экспрессии мезенхимальных маркеров, что приводит к приобретению метастатического фенотипа (Casalino et al., 2023). Было замечено, что MLK3 играет роль в ремоделировании внеклеточного матрикса и активации протеаз, таких как матриксные металлопротеиназы (ММП), которые разрушают внеклеточный матрикс. Это способствует инвазии опухолевых клеток и их распространению в отдаленные участки (Katari et al., 2019). Таким образом, предыдущие исследования показали, что MLK3 играет критическую роль в трижды негативном раке молочной железы (ТНБК). Раттанасинчай и Галло использовали модели ТНБК для изучения роли MLK3 и обнаружили, что он способствует развитию рака посредством специфических сигнальных путей. Они использовали CRISPR/Cas9n для редактирования MLK3 и наблюдали значительное снижение метастазирования ТНБК (Rattanasinchai and Gallo, 2016).
dCas9, часто называемый неактивным Cas9, представляет собой модифицированную производную форму белка Cas9. В отличие от активного Cas9, dCas9 не обладает эндонуклеазной активностью, что делает его неспособным вызывать двуцепочечные разрывы ДНК. Поэтому dCas9 можно использовать для точного воздействия на определенные участки генома без каких-либо изменений или модификаций последовательности ДНК (Wang et al., 2016). В dCas9 два белка эндонуклеазы, RuvC и HNH, инактивируются путем подавления важных аминокислотных остатков (Richter et al., 2016). Несмотря на отсутствие активности расщепления ДНК, dCas9 играет ряд важных ролей в генетических исследованиях и биотехнологии. Например, он позволяет визуализировать определенные участки генома, облегчает регуляцию транскрипции и способствует эпигенетическим модификациям (Brocken et al., 2018).
Транскрипционный фактор ZEB1 (zinc finger E-box binding homeobox 1) играет специфическую и критическую роль в опосредовании эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП), клеточного процесса, происходящего во время эмбрионального развития, регенерации тканей и прогрессирования рака. Он включает трансформацию эпителиальных клеток в мезенхимальные, что приводит к изменениям морфологии клеток, подвижности, инвазивности и т. д. (Wu et al., 2020). ZEB1 ингибирует множество эпителиальных маркеров, таких как E-кадгерин и окклюдин, которые отвечают за поддержание клеточной адгезии и полярности эпителиальных клеток при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) (Moreno-Bueno et al., 2008). Кроме того, ZEB1 активирует определенные маркеры, такие как N-кадгерин, виментин и фибронектин (Konradi et al., 2014), а также регулирует гены, участвующие в ремоделировании цитоскелета, такие как Rho GTPазы и матриксные металлопротеиназы (MMP) (Huang et al., 2014). 2022), кроме того, он также влияет на различные сигнальные пути, такие как трансформирующий фактор роста-β (TGF-β), сигнальный путь Wnt и т. д., тем самым способствуя инвазии опухоли и метастазированию при ТНБК (Chen et al., 2016). Многочисленные исследования и научные данные указывают на то, что ZEB1 обладает большим потенциалом в качестве ценного агента для диагностики и терапевтического вмешательства при ТНБК. В недавнем исследовании Waryah et al. использовали модель ТНБК и добились полного подавления ZEB1 с помощью dCas9. Таким образом, они наблюдали очень высокую специфичность и почти полное ингибирование ZEB1 в условиях in vivo (Waryah et al., 2023).
CRISPR/Cas12 — это инструмент для редактирования генов, называемый CRISPR/Cpf1. Он является производным от системы CRISPR/Cas, где термин Cas12 обозначает ассоциированный с CRISPR белок 12 (Bharathkumar et al., 2022), который полностью аналогичен Cas9. Единственное отличие заключается в том, что он содержит белок Cas12. По сравнению с Cas9, Cas12 обладает некоторыми уникальными функциями, такими как генерация липких концов в процессе редактирования генов, тогда как Cas9 генерирует тупые концы (Wang et al., 2021). Это свойство Cas12 способствует его специфической технологии манипулирования ДНК. Будучи белком, способным точно распознавать и разрезать целевую ДНК, он обладает необычайной универсальностью, что делает его эффективным инструментом для различных применений, включая редактирование генов (Pickar-Oliver and Gersbach, 2019).
Подобно другим вариантам CRISPR, CRISPR/Cas12 также способен нокаутировать или активировать гены при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК), воздействуя на гены, играющие важную роль в его патогенезе или ответе на лечение (Yang и Zhang, 2023). Для осуществления этого процесса была разработана направляющая РНК (gRNA), которая направляет Cas12 к целевому гену. После связывания с мишенью Cas12 вносит двуцепочечные разрывы в ДНК и активирует механизмы репарации ДНК. В процессе репарации могут быть включены неправильные нуклеотиды, что приводит к мутациям генов и потере их функции (Zhang et al., 2021a). Кроме того, для активации генов также использовалась улучшенная версия фермента Cas12 (называемая dCas12). Комбинируя ее с транскрипционным активатором, можно индуцировать определенные гены, тем самым активируя их. Эта технология имеет большой потенциал в содействии активации генов-супрессоров опухолей (Sultan et al., 2022).
Прайм-редактирование — это недавно разработанная и чрезвычайно эффективная технология редактирования генома. Она способна очень точно модифицировать ДНК организма (Чен и Лю, 2023). Прайм-редактирование достигается за счет интеграции двух основных компонентов: модифицированного фермента CRISPR/Cas9 и обратной транскриптазы. Роль фермента CRISPR/Cas9 заключается в избирательном нацеливании на определенные участки генома, в то время как обратная транскриптаза помогает тщательно модифицировать ДНК в целевом месте (Хассан и др., 2021). В механизме прайм-редактирования первый шаг включает создание направляющей РНК для прайм-редактирования (pegRNA) (Стандадж-Бейер и др., 2021). Она содержит целевую последовательность и РНК-шаблон, соответствующий желаемому участку редактирования в целевой ДНК. Затем pegRNA вводится в целевые клетки вместе с нуклеазой для прайм-редактирования (PE2). PE2 — это гибридный белок, состоящий из фермента Cas9, обратной транскриптазы и адаптера для редактирования праймеров (Martín-Alonso et al., 2021). Внутри клетки комплексы pegRNA и PE2 ищут специфическую ДНК, которую они хотят модифицировать. Фермент Cas9 разрезает ДНК и создает матрицу, состоящую из одноцепочечных фрагментов (Choi et al., 2022). Обратная транскриптаза использует эту матрицу для подготовки ДНК к редактированию. Наряду с копированием ДНК, в матрицу также включаются инструкции для редактирования РНК-матрицы. Наконец, вновь созданная нить ДНК используется в качестве матрицы для восстановления разрыва в ДНК, в результате чего образуется измененная последовательность ДНК, содержащая желаемую модификацию (Ochoa-Sanchez et al., 2021). Механизмы редактирования праймеров могут приводить к широко распространенным мутациям в генах. Они могут быть направлены на точечные мутации, вставки, делеции и даже замены генов (Anzalone et al., 2019; Chen and Liu, 2023). Метод прайм-редактирования предлагает ряд преимуществ по сравнению с предыдущими технологиями редактирования генома. К ним относятся повышенная точность, снижение нежелательных побочных эффектов и возможность редактирования ДНК без использования двуцепочечных разрывов ДНК (Anzalone et al., 2020).
Технология CRISPR/Cas9 изначально была разработана для защиты бактерий от переноса плазмид и фаговой инфекции, а позже была перепрофилирована в эффективный инструмент на основе РНК для направленного редактирования генома (Jiang и Doudna, 2017). Кроме того, сообщается, что система CRISPR/Cas9 присутствует в 50% и 87% бактериальных и архейных геномов соответственно (Ishino et al., 2018). CRISPR/Cas9 является потенциальным инструментом для удаления, вставки и коррекции любой аномальной генетической последовательности с использованием режимов in vivo и in vitro (Sabit et al., 2021). Более того, было показано, что CRISPR/Cas9 является частью адаптивной иммунной системы благодаря своей специфичности к целевым генам (Chen и Zhang, 2018).
Система CRISPR/Cas9 состоит из Cas9 и одной направляющей РНК (sgRNA). Cas9 — это эндонуклеаза, состоящая из множества белковых компонентов. Кроме того, Cas9 обладает уникальными структурными и конформационными свойствами (Pacesa et al., 2022), поскольку состоит из двух долей: распознающей (REC) и нуклеазной (NUC). Доля REC далее подразделяется на три области: REC1, REC2 и мостиковые спирали (Cromwell et al., 2018). NUC состоит из трех долей, а именно RuvC (RuvC I, RuvC II, RuvC III), HNH и домена взаимодействия с протоспейсерным смежным мотивом (PAM) (рис. 1) (Song et al., 2016). sgRNA состоит из двух компонентов, включая РНК CRISPR (crRNA) и транскодирующую малую РНК (трассерную РНК) (рис. 1). sgRNA связывает белок Cas9 с коннексинами, образуя активный комплекс, также известный как эффекторный комплекс (Richter et al., 2012). crRNA представляет собой пару оснований длиной 18–20 нуклеотидов, играющую критическую роль в распознавании целевых последовательностей ДНК. Кроме того, crRNA образует пары с целевой ДНК, а tracrRNA служит каркасом для связывания нуклеазы Cas9 с целевой ДНК (Manghwar et al., 2019). С другой стороны, последовательность PAM состоит из 3 нуклеотидов, которые подтверждают, определяют и опосредуют связывание эффекторного комплекса с ДНК. Субъединицы белкового комплекса Cas9 RuvC и HNH обладают каталитической активностью (Richter et al., 2012; Asmamaw and Zawdie, 2021). Нуклеазный домен HNH субъединицы Cas9 расщепляет нить ДНК, связанную с crRNA. Нуклеазный домен RuvC расщепляет другие нити ДНК и вызывает двуцепочечные разрывы (DSB), после чего активируются два различных механизма репарации разрывов ДНК (Jiang и Doudna, 2017) (Рисунок 1).
Рисунок 1. Обзор системы CRISPR/Cas9 (A). Компоненты системы CRISPR/Cas9: (i) эндонуклеаза Cas9 отвечает за разрезание целевой последовательности ДНК, (ii) одноцепочечная направляющая РНК (sg-РНК), полученная в результате слияния химер crRNA и tra-crRNA. (2) Cas9 включает несколько компонентов, таких как Rec I, Rec II, NUC-домен (HNH и Ruv C являются субкомпонентами) и домен взаимодействия PAM (C) с соответствующими функциями. Белковый комплекс CRISPR/Cas9 расщепляет последовательности ДНК на некомплементарные и комплементарные формы (D). CRISPR/Cas9 редактирует геном в три этапа: распознавание, разрезание и репарация. Разработанная sg-РНК направляет Cas9 и распознает желаемую последовательность через комплементарный компонент crRNA. Cas9 распознает последовательность PAM в положении 5′-NGG-3′ и расплавляет ДНК, образуя гибрид ДНК-РНК и активируя расщепление. Домен HNH Cas9 расщепляет комплементарную нить, а домен RuvC расщепляет некомплементарную нить. CRISPR/Cas9 восстанавливает двухцепочечную ДНК, разрывая ее двумя способами: негомологичным соединением концов (NHEJ) и гомологично-направленной репарацией (HDR). NHEJ восстанавливает двухцепочечную ДНК в отсутствие чужеродной гомологичной ДНК посредством ферментативного процесса, механизма, подверженного ошибкам, который может вставлять или удалять случайные последовательности ДНК. HDR является очень специфичным и требует наличия гомологичных ДНК-шаблонов.
К механизмам репарации, опосредованным CRISPR/Cas9, относятся негомологичное соединение концов (NHEJ) и гомологично-направленная репарация (HDR). NHEJ — это путь, чреватый ошибками, поскольку он включает вставку или удаление и не требует какой-либо определенной последовательности в процессе репарации. Он использует случайные нуклеотиды для генерации стандартных белков (Abbasi et al., 2021). Эта система репарации состоит из четырех комплексов, таких как комплекс KU, комплекс кросс-комплементирующих белков типа 4 (XRCC-4), фермент обработки концов ДНК и протеинкиназа ДНК-PKcs (Abbasi et al., 2021). Белковый комплекс KU состоит из двух субъединиц, Ku 70 и Ku 80, и играет важную роль в механизме NHEJ, поскольку механизм репарации инициируется связыванием двух субъединиц (Ku 70 и Ku 80) с тупыми или почти тупыми концами целевой ДНК (Abbasi et al., 2021), служа каркасом для привлечения других факторов, связанных с NHEJ, к месту повреждения (Yang et al., 2020). XRCC-4 и ДНК-лигаза состоят из 334 и 911 аминокислот соответственно, а комплекс XRCC4-ДНК-лигаза IV стимулирует лигирование концов ДНК (Chatterjee et al., 2015). Фермент обработки концов ДНК, также известный как полинуклеотидкиназа 3'-фосфат, является ферментом обработки концов ДНК. Она может удалять 3′P-группу в ДНК и фосфорилировать 5′OH-группу во время репарации двуцепочечных разрывов ДНК (DSB). Она также участвует в репарации одноцепочечных разрывов (SSB) с использованием пути репарации SSB (Chatterjee et al., 2015). Протеинкиназа ДНК-PKcs — это ДНК-зависимая протеинкиназа, состоящая из каталитической субъединицы PIKK (киназ, связанных с фосфатидилинозитол-3-киназой) и семейства ATM (атаксия-телангиэктазия-мутированный), а также ATM и Rad3-связанных ATR. Она способна репарировать двуцепочечные разрывы ДНК (DSB) и одноцепочечные разрывы (Yue et al., 2020; Peng et al., 2016).
HDR является более точным и подходящим механизмом репарации, поскольку информация копируется с использованием неповрежденной формы гомологичного дуплекса ДНК, хотя и требует наличия сестринских хроматид. Это происходит во время S/G2 фазы клеточного цикла млекопитающих. HDR в основном встречается у дрожжей, но NHEJ имеет решающее значение у млекопитающих (Burma et al., 2006; Abbasi et al., 2021). Полный механизм репарации показан на рисунке 1.
Поскольку трижды негативный рак молочной железы (ТНБК) вызывается генетическими и эпигенетическими аномалиями, коррекция злокачественных геномных/эпигеномных аномалий с помощью CRISPR/Cas9 может быть разумным терапевтическим подходом (Chen et al., 2019). Кроме того, некоторые факторы транскрипции, участвующие в клеточно-специфической регуляции транскрипции, могут проявлять уникальные характеристики раковых клеток, что предполагает, что регуляция транскрипции может быть отличным подходом к лечению рака (Drost et al., 2017). Использование этих молекулярных особенностей опухолей, таких как генетические, эпигенетические и транскрипционные дефекты, для разработки лекарств может улучшить клинические результаты и снизить затраты на скрининг. CRISPR — это потенциальный инструмент редактирования генов, который может не только обнаруживать и идентифицировать вызывающие рак геномные мишени, но и использоваться для редактирования, подавления и эпигенетической модификации онкогенов в клетках человека (Таблица 1) (Ahmed et al., 2021). Было проведено несколько скринингов с использованием CRISPR для поиска генов, связанных с супрессорами опухолей, онкогенами и лекарственной устойчивостью. Использование CRISPR/Cas9 для редактирования различных онкогенов TNBC показано на рисунке 2.
Рисунок 2. Редактирование генов различных онкогенов TNBC с использованием CRISPR/Cas9, приводящее к снижению роста опухоли и метастазирования. К этим онкогенам относятся CDK7, NAT1, UBR5, YTHDF2, ITGA9, CXCR4 и CXCR7, Crypto1, ROR1 и ST8SIA, которые участвуют в возникновении и метастазировании TNBC.
Миграция, инвазия и эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) раковых клеток связаны с ITGA9. Предыдущие исследования показали, что ITGA9 является ключевым участником сигнального пути Notch и играет важную роль в метастазировании рабдомиосаркомы (Molist et al., 2020). Кроме того, было обнаружено, что ITGA9 тесно связан с прогнозом заболевания у пациентов с несколькими типами опухолей, включая рак молочной железы (Wang Z. et al., 2019). Биоинформатический анализ ITGA9 показал, что его экспрессия при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) значительно выше, чем при других подтипах рака молочной железы. Повышенные уровни ITGA9 связаны с метастазированием и рецидивом опухоли у пациентов с ТНБК. Нокаут гена ITGA9 с помощью CRISPR/Cas9 привел к появлению свойств, подобных свойствам раковых стволовых клеток (РСК), ангиогенезу опухоли, росту опухоли и снижению метастазирования за счет стимуляции деградации β-катенина при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) (Wang Z. et al., 2019).
Крипто-1 является членом семейства TGF-β и имеет решающее значение для раннего эмбриогенеза, поддержания стволовых клеток и метастазирования рака (Ishii et al., 2021). Также известный как Tdgf-1, это онкогенный сигнальный белок, заякоренный GPI, участвующий в регуляции формирования примитивной полоски, мезодермы и эндодермы, а также в установлении лево-правой асимметрии в развитии органов тела во время эмбриогенеза (Zhang et al., 2021b). Кроме того, было показано, что Крипто-1 участвует в эпителиально-мезенхимальном переходе (ЭМП) в качестве маркера стволовых клеток (Zhang et al., 2021b). ЭМП имеет решающее значение не только для различных процессов, таких как эмбриональное развитие, фиброз и заживление ран, но и для инвазии и метастазирования рака. Кроме того, было показано, что Crypto-1 взаимодействует с четырьмя рецепторами Notch и усиливает их посттрансляционное созревание (Brandstadter and Maillard, 2019). Известно, что сигнальный путь Notch участвует в поддержании жизнеспособности клеток рака молочной железы человека. Исследования показали, что нокаут Crypto-1 с помощью CRISPR/Cas9 подавляет рост и метастазирование раковых клеток. Следовательно, Crypto-1 может стать важной терапевтической мишенью для TNBC (Castro et al., 2015).
Белок XCL12 и его хемокиновый рецептор CXC (CXCR4 и CXCR7) играют различные роли в пролиферации, росте, миграции и инвазии раковых клеток (Wu et al., 2015). Эти хеморецепторы были связаны с развитием трижды негативного рака молочной железы (ТНБК) посредством множественных сигнальных путей как в моделях in vivo, так и in vitro (Wu et al., 2015). Кроме того, активация CXCR4 и CXCR7 связана с большей восприимчивостью к метастазированию и плохим прогнозом при ТНБК (Karn et al., 2022). Следовательно, нокаут CXCR4 и CXCR7 может стать эффективными мишенями для лекарственной терапии рака молочной железы, включая ТНБК. Исследование Yang et al. Ян и др. (2019) использовали CRISPR/Cas9 для одновременного нокаута генов CXCR4 и CXCR7 и обнаружили, что пролиферация, рост, миграция и инвазия TNBC были значительно подавлены (Ян и др., 2019).
В тканях рака молочной железы наблюдалось повышение уровня miR-3662, онкогена, вызывающего трижды негативный рак молочной железы (ТНБК) (Yi et al., 2022). Было показано, что подавление miR-3662 ингибирует рост и метастазирование опухоли молочной железы как in vivo, так и in vitro (Agarwal and Gupta, 2021). HBP-1 является мощным ингибитором сигнального пути Wnt/-catenin и, вероятно, отвечает за опосредованный miR-3662 рост клеток ТНБК. Недавно Yi et al. обнаружили, что ось miR-3662-HBP1 регулирует сигнальный путь Wnt/-catenin в клетках ТНБК (Yi et al., 2022). Благодаря своей специфической для опухоли экспрессии, miR-3662 может быть потенциальной терапевтической мишенью для ТНБК. Таким образом, подавление экспрессии miR-3662 с помощью системы CRISPR/Cas9 может стать отличным подходом для разработки новых лекарств для лечения трижды негативного рака молочной железы.
UBR5 — это нуклеофосфопротеин массой 300 кДа, который был идентифицирован как ключевой регулятор канцерогенеза, метастазирования и иммунного ответа при различных видах рака (Shearer et al., 2015; Fu et al., 2023). Сообщается, что UBR5 значительно повышен в образцах TNBC и стимулирует функцию ERα, индуцируя пролиферацию посредством своей убиквитинлигазной активности (Bolt et al., 2015). Исследования полногеномного секвенирования первичных образцов TNBC также показали повышенную экспрессию UBR5, что указывает на его роль в развитии TNBC. Кроме того, удаление UBR5 с помощью CRISPR/Cas9 показало значительное ингибирование метастазирования и роста TNBC в экспериментальных моделях на мышах. Более того, включение UBR5 в модель мыши дикого типа восстановило его полную функциональность, тогда как этот эффект не наблюдался в инактивированных мутантных штаммах (Liao et al., 2017). Отсутствие UBR5 связано с усилением апоптоза, некроза и ингибированием роста опухоли при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) из-за плохого ангиогенеза. Из-за потери UBR5 снижается распространение опухоли в отдаленные органы, и UBR5 индуцирует аномальный эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП) главным образом за счет снижения экспрессии Е-кадгерина (Zhang and Weinberg, 2018). Недавно было показано, что UBR5 является очень важным фактором в транскрипции PDL1, индуцированной ИФН-γ, при ТНБК из-за отсутствия у него активности убиквитинирования E3. Анализ РНК-транскриптома показал, что UBR5 может оказывать системное воздействие на гены, связанные с путем ИФН-γ, и способствовать трансактивации PDL1 за счет повышения уровня активации РНК протеинкиназы (PKR) и ее сигнальных трансдукторов и активаторов. транскрипция 1 (STAT1) и интерферон-регуляторный фактор 1 (IRF1). Однако комбинированное подавление экспрессии UBR5 и PD-L1 с помощью CRISPR/Cas9 оказывает синергический терапевтический эффект, превосходящий эффект любой из этих блокад по отдельности, с существенным воздействием на микроокружение опухоли (Wu et al., 2022). Таким образом, CRISPR/Cas9 может стать важным инструментом для ингибирования функции UBR5, тем самым подавляя метастазирование и рост опухоли при трижды негативном раке молочной железы.
ROR1 — это трансмембранный белок I типа, экспрессирующийся во время развития рака и эмбрионального развития, и идентифицированный как онкофетальный белок (Николас Борчердинг, 2014). Инвазивное поведение различных видов рака человека связано с повышением уровня ROR1. Обнадеживающие результаты были получены в исследованиях in vivo и in vitro с использованием терапевтических соединений, нацеленных на ROR1 (Чьен и др., 2016). Повышенные уровни мРНК ROR1 в биопсиях тканей молочной железы также были связаны с агрессивными базально-подобными опухолями молочной железы (БЛ) и их миграцией в другие части тела. Более того, сверхэкспрессия ROR1 была идентифицирована как прогностический маркер развития трижды негативного рака молочной железы (ТНБК) (Чьен и др., 2016). Однако подавление ROR1 с помощью CRISPR/Cas9 для подавления роста и метастазирования ТНБК было бы эффективной стратегией.
Процесс сиалирования включает добавление сиаловой кислоты к гликоконъюгатам, которое катализируется сиалилтрансферазами (СТ). ST8SIA1 принадлежит к семейству СТ и играет важную роль в патогенезе различных заболеваний, таких как лимфоцитарный лейкоз и колоректальный рак (Chang et al., 2018). Анализ последовательности РНК показывает, что ST8SIA1 высоко экспрессируется в тканях молочной железы пациентов с трижды негативным раком молочной железы (ТНБК) и положительно коррелирует с мутациями в гене-супрессоре опухоли p53, что может способствовать патогенезу ТНБК (Battula et al., 2017). Кроме того, ST8SIA1 участвует в метастазировании и рецидиве ТНБК, что указывает на его важную роль в возникновении и развитии этого заболевания. В экспериментальной модели тройно-негативного рака молочной железы (ТНБК) in vitro было показано, что подавление экспрессии гена ST8SIA1 с помощью CRISPR/Cas9 блокирует рост и метастазирование (Battula et al., 2017). Это позволяет предположить, что CRISPR/Cas9 может быть важным инструментом для ингибирования функции онкогена ST8SIA1 при лечении ТНБК.
NAT1 — это метаболический фермент, катализирующий образование ксенобиотических соединений II фазы и экспрессирующийся почти во всех тканях человека. NAT1 может использовать кофактор фолат для расщепления ацетил-КоА (ацетил-КоА) даже в отсутствие ароматического аминного субстрата (Stepp et al., 2015; Laurieri et al., 2014). Исследования показали, что NAT1 регулирует функцию матриксной металлопротеиназы 9 (MMP9) в моделях клеток рака молочной железы и защищает от активных форм кислорода (АФК) во время голодания по глюкозе (Wang et al., 2018). Было показано, что удаление NAT1 ингибирует комплекс пируватдегидрогеназы, что приводит к митохондриальной дисфункции (Wang L. et al., 2019). Кроме того, различные другие исследования показали, что ингибирование NAT1 с помощью малых молекул и подавления экспрессии с помощью siRNA может снизить инвазивность и пролиферацию клеток рака молочной железы (Stepp et al., 2018). Недавно CRISPR/Cas9 был использован для подавления NAT1 в клеточной линии рака молочной железы MDA-MB-231, влияя на клеточный метаболизм в зависимости от уровня его экспрессии. Это исследование также показало, что NAT-1 имеет решающее значение для прогрессирования и метастазирования TNBC (Carlisle et al., 2020).
Скоординированная транскрипция онкогенов регулируется суперэнхансерами, факторами транскрипции и кофакторами (Hnisz et al., 2015). Кроме того, для регуляции транскрипции необходима группа циклин-зависимых киназ (CDK), таких как CDK7, CDK8, CDK9, CDK12 и CDK13. Среди них CDK7 участвует в фосфорилировании РНК-полимеразы II, что очень важно для инициации и расширения транскрипции онкогенов в патогенезе тройно-негативного рака молочной железы (ТНБК). В основополагающем исследовании удаление CDK7 с помощью CRISPR/Cas9 ингибировало ТНБК, указывая на то, что патогенез ТНБК зависит от CDK7 (Wang Y. et al., 2015).
Исследования показали, что мутации в генах MYC и RBP (РНК-связывающий белок) могут приводить к апоптозу, в то время как мутации отдельных генов MYC или RBP не влияют на рост раковых клеток (Einstein et al., 2021). Более 1000 РБП в геноме человека были исследованы с использованием библиотеки на основе CRISPR/Cas9. Среди них 57 РБП оказались критически важными для роста раковых клеток с сильно повышенным уровнем MYC (Wheeler et al., 2020). Кроме того, YTHDF2 важен для поддержания роста клеток TNBC и снижает количество метилированных транскриптов во время высокоуровневой транскрипции и трансляции в раковых клетках с более высокой экспрессией MYC. Кроме того, YTHDF2 не является необходимым для раковых клеток, которые в меньшей степени зависят от повышенного уровня MYC для продления выживания пациентов с трижды негативным раком молочной железы (Эйнштейн и др., 2021), что позволяет предположить, что он может быть потенциальной терапевтической мишенью для препаратов, способных преодолеть трижды негативный рак молочной железы.
Белки с цинковыми пальцами (ZNF) составляют приблизительно 1% от общего генома человека. Исследования показали, что ZNF могут регулировать пролиферацию клеток при различных видах рака, таких как рак печени, рак молочной железы и колоректальный рак (Zhang W. et al., 2021; Li et al., 2017). Библиотеки, созданные с помощью нокаута CRISPR, использовались для скрининга различных генов-супрессоров опухолей (TSG) в клетках рака молочной железы (Shalem et al., 2014). С тех пор транскриптомное исследование клеток рака молочной железы с удаленным геном ZNF319 с помощью CRISPR/Cas9 показало, что ZNF319 является геном-супрессором опухолей, который снижает пролиферацию клеток рака молочной железы и, следовательно, участвует в различных потенциальных сигнальных механизмах и других биологических функциях (Wang L. et al., 2022).
Ферроптоз — это тип запрограммированной клеточной смерти, зависящий от наличия железа. Известно, что развитие ферроптоза зависит от присутствия перекисей липидов. Кроме того, сообщалось, что PKCβII демонстрирует раннее перекисное окисление липидов, а повышенное перекисное окисление липидов связано с ферроптозом. Скрининг библиотеки ингибиторов киназ, опосредованных CRISPR/Cas9, показал, что PKCβII участвует в процессе перекисного окисления липидов, который имеет решающее значение для ферроптоза в клетках MDA-MB-231 (Zhang et al., 2022). Таким образом, это предполагает, что нокаут PKCβII с помощью CRISPR/Cas9 может быть потенциальной мишенью для генов-супрессоров опухолей при лечении заболеваний, связанных с ферроптозом (Zhang et al., 2022).
Считается, что лекарственная устойчивость является причиной примерно 90% смертей среди онкологических больных и представляет собой одну из главных проблем в лечении рака (Bukowski et al., 2020). Результаты показывают, что достаточное количество генов, связанных с выведением лекарств, репарацией ДНК, апоптозом и различными сигнальными путями клеток, ассоциировано с лекарственной устойчивостью (Haider et al., 2020). Среди них несколько генов были выбраны в качестве мишеней для инструментов CRISPR/Cas9 и показали многообещающие результаты в снижении лекарственной устойчивости и повышении эффективности противораковых методов лечения (Vaghari-Tabari et al., 2022). Кроме того, библиотеки для высокопроизводительного скрининга нокаутированных генов с помощью CRISPR/Cas9 были задействованы в модификации функций потенциальных целевых генов лекарственной устойчивости (Shalem et al., 2015). Для идентификации генов резистентности к паклитакселу было использовано секвенирование РНК в сочетании со скринингом библиотеки sgRNA по всему геному для выявления восьми генов-кандидатов, включая гистондеацетилазу 9 (HDAC9), которые связаны с лекарственной резистентностью у пациентов с рецидивирующим трижды негативным раком молочной железы (ТНБК) (B et al., 2020). В другом исследовании было отмечено увеличение экспрессии дизерин/треонин- и тирозинпротеинкиназы (DSTYK) во время выживания пациентов с ТНБК, получавших противоопухолевые препараты. Более того, нокдаун DSTYK с помощью CRISPR/Cas9 значительно усилил апоптоз лекарственно-устойчивых раковых клеток in vitro (клетки SUM102PT и MDA-MB-468) и в модели ТНБК in vivo (Ogbu et al., 2021).
Несмотря на то, что при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) наблюдается аномальная активация сигнального пути MAPK, клиническая эффективность терапии, направленной на MEK, невелика. Скрининг геномной библиотеки с помощью CRISPR/Cas9 показал, что ингибирование PSMG2 (шаперона сборки протеома 2) повышает чувствительность клеток ТНБК BT549 и MB468 к ингибитору MEK AZD6244. Нокдаун PSMG2 с помощью CRISPR/Cas9 изменяет нормальную функцию протеасомы, приводя к аутофагически опосредованной дезассемблированию PDPK1, что дополнительно улучшает состояние опухолевых клеток в мышиных моделях ТНБК, индуцированных AZD6244 (ингибитор MEK) и MG132 (ингибитор протеасомы). Таким образом, ингибиторы протеасомы и MAP-киназы (MEK) могут применяться синергически для снижения пролиферации опухолевых клеток (Wang X. et al., 2022).
Система CRISPR/Cas9 также использовалась для скрининга потери функции гена, приводящей к резистентности к трижды негативному раку молочной железы (ТНБК) (Шу и др., 2020). Ге и др. объяснили механизм лекарственной резистентности раковых клеток, обработанных JQ1, ингибитором бромодомена BET (BBDI), при ТНБК. Используя CRISPR/Cas9, они обнаружили, что удаление гена rb1 приводит к тому, что ТНБК становится резистентным к противораковому препарату JQ1. Следовательно, функция rb1 важна для ответа на препараты JQ1 при ТНБК. Они также сообщили, что паклитаксел является ингибитором киназы CDK4/6/микротрубочек, и его комбинация с BBDI, такими как JQ1, может обеспечить многообещающие терапевтические ответы на лекарственно-устойчивый ТНБК (Ге и др., 2020).
Сообщается, что транскрипционный ландшафт длинных некодирующих РНК (lncRNA) отвечает за резистентность к неоадъювантной терапии при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК). В данном исследовании показано, что пять различных транскриптов lncRNA MALAT1 высоко экспрессируются при ТНБК. Кроме того, удаление MALAT1 с помощью CRISPR/Cas9 повысило чувствительность клеток ТНБК BT-549 к паклитакселу и доксорубицину, что указывает на потенциальную роль MALAT1 в резистентности при ТНБК (Shaath et al., 2021).
Мутации в гене BRCA1 (BRCA1m) гетерогенны и поэтому их трудно обнаружить. Воздействие на PARP1 (поли(АДФ-рибоза) полимеразу), синтетически летального партнера BRCA1, может повысить химиочувствительность TNBC к лекарственным препаратам. С помощью CRISPR/Cas9 удаление PARP1 повысило чувствительность противоопухолевых препаратов, таких как доксорубицин, гемцитабин и доцетаксел, к клеткам TNBC с мутацией mBRCA1, что предполагает участие PARP1 в лекарственной устойчивости при TNBC (Vaghari-Tabari et al., 2022). Известно, что мутации в генах-супрессорах опухолей BRCA1 или BRCA2 увеличивают вероятность развития рака молочной железы у людей. Лечение таких пациентов требует применения ингибиторов PARP. Кроме того, было показано, что нокаут фактора реутилизации нуклеотидов DNPH1 с помощью CRISPR/Cas9 может удалить токсичный нуклеотид 5-гидроксиметилдезоксиуридин (hmdU) монофосфат, тем самым усиливая реакцию клеток с дефицитом BRCA на ингибиторы PARP (Fugger et al., 2021). Таким образом, CRISPR/Cas9 и ингибиторы PARP1 могут стать важной стратегией лечения трижды негативного рака молочной железы.
Ген пенетрантного гликопротеина (P-gp) является геном множественной лекарственной устойчивости, который, как правило, активируется примерно в 41% всех случаев трижды негативного рака молочной железы (ТНБК) (Sun et al., 2020). Индуцированный P-gp отток лекарственных препаратов был идентифицирован как ключевой регулятор лекарственной устойчивости при раке молочной железы. Ингибиторы P-gp продемонстрировали повышенную чувствительность к противоопухолевым препаратам при раке молочной железы (Famta et al., 2021). Таким образом, опосредованное CRISPR/Cas9 подавление или ингибирование P-gp и ингибиторов P-gp может стать очень важным методом преодоления лекарственной устойчивости при ТНБК.
Известно, что АТФ-связывающий кассетный транспортер G2 (ABCG2) вызывает лекарственную устойчивость при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) (Palasuberniam et al., 2015), хотя в настоящее время нет сообщений о связи между CRISPR/Cas9 и подавлением ABCG2, а также инактивацией генов-супрессоров опухоли. PTEN может усиливать активацию ABCG2 (Palasuberniam et al., 2015), (Deepak Singh et al., 2021). Поэтому использование CRISPR/Cas9 для удаления ABCG2 и его сочетание с ингибитором ABCG2 может быть подходящим методом лечения для преодоления лекарственной устойчивости при ТНБК. В таблице 2 указаны CRISPR/Cas9, нацеленные на все гены резистентности.
Таблица 2. Система CRISPR/Cas9 нацелена на различные гены резистентности TNBC для повышения чувствительности клеток к противоопухолевым препаратам.
Библиотеки CRISPR/Cas9 являются потенциальными инструментами для скрининга генных мутаций, связанных с патогенезом рака (Chan et al., 2022). Этот метод скрининга включает четыре этапа: (а) создание библиотеки, (б) лентивирусная трансдукция, (в) фенотипический скрининг и (г) анализ целевых генов. Хотя при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) наблюдается аномальная активация сигнального пути MAPK, клинический прогноз таргетной терапии MEK для пациентов с ТНБК, имеющих мутации в генах-супрессорах опухолей, таких как PTEN, RB1 и TP53, очень неблагоприятный.
Кроме того, с помощью скрининга с использованием нокаута генов и системы CRISPR/Cas9 была протестирована наиболее эффективная и селективная молекула, дегидрокатрол, которая в большом количестве содержится в экстрактах цветков и листьев из Гватемалы, чтобы понять влияние дегидрокатрола на клетки MDA-MB-231. Механизмы селективной цитотоксичности клеток. Характеристики мезенхимальных стволовых клеток подтипов TNBC. Этот скрининг на основе CRISPR/Cas9 также показал, что ген HSD17B11, кодирующий 17β-гидроксистероиддегидрогеназу типа 11, высоко экспрессируется в клетках MDA-MB-231 и приводит к образованию дегидрофалькаринола, специфичного для клеток MDA-MB-231 (Grant et al., 2020). Таким образом, это говорит о том, что геномный скрининг с использованием CRISPR/Cas9 обладает большим потенциалом в выявлении механизмов, лежащих в основе противораковых свойств потенциальных природных соединений.
Кроме того, уязвимость TNBC к раку изучалась с помощью непредвзятого полногеномного скрининга in vivo с использованием CRISPR/Cas9, который показал связь между онкогенными и опухолесупрессорными путями. Сообщается, что ключевые компоненты путей mTOR и Hippo играют важную роль в регуляции опухоли при TNBC. Кроме того, исследования показали, что фармакологическое ингибирование онкопротеинов mTORC1/2 и YAP эффективно подавляет патогенность TNBC с использованием модели синергии лекарственного препарата и матрикса in vitro, а также ксенотрансплантатов, полученных от пациентов, in vivo. Более того, ингибирование mTORC1/2, опосредованное Torin-1, усиливает макропиноцитоз, тогда как ингибирование YAP, индуцированное вертепорфином, приводит к гибели клеток TNBC. В совокупности эти результаты подчеркивают эффективность и надежность полногеномного скрининга in vivo с использованием CRISPR для выявления новых и эффективных методов лечения TNBC (Dai et al., 2021).
Нарушение регуляции иммунной системы является важным фактором в развитии опухолей. Раковые клетки избегают иммунного уничтожения, обходя защитные механизмы, включая вмешательство в активность иммунных клеток в микроокружении опухоли и ослабление иммунной системы. Поэтому разработка улучшенной иммунной системы может стать ключевым подходом к борьбе с опухолями. Использование генной модификации на основе CRISPR/Cas9 решает ряд проблем, связанных с дисфункцией иммунной системы, с разных точек зрения. CRISPR/Cas9 использовался для улучшения противоопухолевого иммунитета против рака молочной железы посредством следующих путей (рис. 3).
Рисунок 3. Иммунотерапия с использованием CRISPR/Cas9 нацелена на клетки TNBC. Потеря CDK5 и подавление экспрессии PDL1 и CD155 усиливают иммунную систему. Аналогично, потеря A2AR и подавление экспрессии опухолевых антигенов, таких как HER2, муцин 1 и TEM8, повысили эффективность CAR-T-клеток в уничтожении раковых клеток. Скрининг Т-клеток с использованием CRISPR/Cas9 показал, что нарушение киназы p38 усиливает противоопухолевую активность Т-клеток. Т-клетки, модифицированные с помощью CRISPR/Cas9, увеличивают экспрессию TCR (Т-клеточного рецептора), в результате чего Т-клетки приобретают противоопухолевую активность.
Цель иммунотерапии — стимулировать иммунную систему к атаке раковых клеток. Сверхэкспрессия белков иммунных контрольных точек обычно предотвращает аутоиммунные реакции, но может помочь раковым клеткам избежать их (Topalian et al., 2015). Эти белки предотвращают иммунные реакции, связываясь с рецепторами на поверхности иммунных клеток. Множество белков контрольных точек (таких как CD155 и PD-L1) нацелены на рецептор PD-1 на иммунных клетках и экспрессируются при раке молочной железы, особенно при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) (Li Y.-C. et al., 2020). Нокдаун PD-L1 или его рецептора с помощью CRISPR/Cas9 может стимулировать иммунную систему к атаке опухолей ТНБК (Yahata et al., 2019). Кроме того, было показано, что снижение экспрессии PD-L1 посредством CRISPR/Cas9-опосредованного удаления CDK5 ингибирует рост опухоли in vitro и in vivo (Deng et al., 2020). Ингибирование роста в моделях рака молочной железы in vitro и in vivo предполагает, что опосредованное shRNA снижение уровня CD155 может оказывать терапевтический эффект при раке молочной железы (Gao et al., 2018).
CAR T-клетки экспрессируют CAR-рецепторы, распознающие опухолеассоциированные антигены (ТАА), и могут использовать подавление экспрессии контрольных белков для усиления своей активности (Li C. et al., 2020). Существуют различные потенциальные мишени для терапии CAR T-клетками при раке молочной железы, включая несколько ТАА, таких как HER2, муцин1 и TEM8 (Bajgain et al., 2018). Есть данные, что CAR T-клетки, нацеленные на мезотелин (сверхэкспрессируемый в клетках TNBC BT-459), более эффективны против рака при подавлении экспрессии PD-1 с помощью CRISPR/Cas9 (Hu et al., 2019). Однако выделение Т-клеток от пациентов и их последующее редактирование ex vivo — это трудоемкий и длительный процесс. Хотя универсальные Т-клетки могут снизить требования к изоляции, донорские Т-клетки, экспрессирующие человеческий лейкоцитарный антиген (HLA) класса I и Т-клеточный рецептор (TCR), следует удалять, чтобы предотвратить аномалии «трансплантат против хозяина» (Ren et al., 2017, 2017a). Используя CRISPR/Cas9, HDR может одновременно элиминировать TCR и HLA и нокаутировать ген, кодирующий CAR. Исследования показали, что CRISPR/Cas9 можно использовать для введения анти-CD19 CAR в локус TCR, тем самым эффективно производя CAR без истощения Т-клеток (Dimitri et al., 2022). Были разработаны мультиплексные технологии для генерации аллогенных CAR Т-клеток путем одновременной элиминации TCR, бета-2-микроглобулина (B2M), субъединицы HLA-I и других белков, таких как PD-1 и CTLA-4, которые могут обладать более выраженными противораковыми свойствами. против TNBC (Eyquem et al., 2017; Liu et al., 2017; Ren et al., 2017b; Dimitri et al., 2022).
Использование CRISPR/Cas9 может повысить эффективность CAR-T-клеток. Известно, что аденозин обладает иммуносупрессивными свойствами и может снижать противоопухолевый иммунитет, блокируя функцию Т-клеток и активируя аденозиновые рецепторы A2A (A2AR) (Vigano et al., 2019). Подавление A2AR с помощью CRISPR/Cas9 значительно повысило эффективность CAR-T-клеток in vivo (Giuffrida et al., 2021). Известно, что Т-клетки проявляют различные фенотипические характеристики, такие как клеточное размножение, дифференцировка, окислительный стресс и геномный стресс. Скрининг Т-клеток с использованием CRISPR/Cas9 выявил нарушение 25 различных киназ рецепторов Т-клеток. Среди них было показано, что удаление киназы p38 усиливает противоопухолевую активность Т-клеток, что указывает на то, что киназа p38 является ключевым регулятором регуляции CAR-T-клеток (Gurusamy et al., 2020).
Т-клетки можно генетически модифицировать с помощью CRISPR/Cas9 для получения высокоэкспрессируемых TCR. Перенос генетически модифицированных Т-клеток пациентам показал более сильную противораковую активность, чем эндогенные Т-клетки. Следовательно, эндогенные TCR могут конкурировать с генетически модифицированными TCR у пациентов, что может повлиять на потенциал иммунотерапии рака. Для решения этой проблемы использование CRISPR/Cas9 для удаления эндогенного TCR-β в клетках-реципиентах и последующий перенос Т-клеток с TCR-β онкологическим больным может обеспечить лучшие противораковые иммунные ответы без необходимости конкуренции со стороны эндогенных TCR (Fan et al. 2018). Таким образом, за исключением Т-клеток, модифицированных CRISPR, TCR в тысячу раз более чувствительны к опухолевым антигенам, чем нормальные Т-клетки, трансдуцированные TCR. Кроме того, при различных формах лейкемии модифицированные Т-клетки, созданные с помощью γδ TCR+ CRISPR, демонстрируют более высокую экспрессию CD4+ и CD8+ Т-клеток, чем при стандартной трансплантации TCR (Legut et al., 2018). Таким образом, модифицированные Т-клетки, созданные с помощью CRISPR/Cas9, могут стать эффективным методом иммунотерапии для преодоления тройно-негативного рака молочной железы.
Интегрины — это молекулы клеточной адгезии, присутствующие в клеточных трансмембранах и способствующие связыванию клеток с внеклеточным матриксом (ВКМ) (Hamidi и Ivaska, 2018). Дисрегуляция интегринов связана с развитием и миграцией раковых клеток за счет изменения внеклеточного матрикса, что приводит к выживанию раковых клеток в кровообращении (Hamidi и Ivaska, 2018). Нокдаун интегринов с помощью CRISPR/Cas9 замедляет прогрессирование опухоли, метастазирование и колонизацию при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК). Сообщалось, что нокдаун интегрина α5 (ITGA5) снижает миграцию и прогрессирование клеток при других видах рака, таких как рак легких (Ju et al., 2017), что предполагает, что интегрин α5 также может быть ключевым фактором в патогенезе ТНБК.
Создание нокаутных мышей с использованием традиционных методов эмбриональных стволовых (ЭС) клеток — трудоемкий, длительный и неэффективный процесс. Для этого требуются месяцы и годы, чтобы целенаправленно воздействовать на ЭС-клетки посредством гомологичной рекомбинации, вывести химерных мышей, а затем скрестить их с гетерозиготными мышами для получения гомозиготного потомства. Для создания мышей с множественными генетическими мутациями требуется сложное скрещивание. Однако при использовании мышей, полученных путем абляции ЭС-клеток с помощью CRISPR/Cas9 или путем микроинъекции компонентов CRISPR/Cas9 в оплодотворенные яйцеклетки одной клетки, возникают многочисленные проблемы. Например, внесение изменений часто происходит в биаллельных локусах и не является генно-специфичным. Недавно было сообщено, что ЭС-клетки, использующие технологию CRISPR/Cas9, могут одновременно вводить биаллельные мутации в до 5 генов (Nishizono et al., 2021). Для этой цели в ЭС-клетки одновременно трансфицировали мРНК Cas9 и пять ген-специфических gRNA. Это подчеркивает перспективность и эффективность данной процедуры, хотя эти мутации могли передаваться при скрещивании исходных линий для получения мышей с пятикратным нокаутом. В исследовании также сообщается об удивительном открытии: эмбриональные стволовые клетки больше не требуются для создания генетически модифицированных мышей. Вместо этого, для удаления специфических генных продуктов, мРНК и gRNA Cas9 вводились в эмбрионы на стадии одной клетки. В результате были созданы линии-основатели с нокаутом, которые теоретически могут быть использованы для изучения последствий делеции генов у мышей (Qin et al., 2016). Таким образом, CRISPR/Cas9 позволяет создавать трансгенных мышей для лечения ТНБК с меньшими затратами, чем традиционная генная инженерия. С помощью системы CRISPR/Cas была разработана новая модель мыши с нокаутом, которая может успешно вводить точечные мутации в один или несколько эндогенных генов при ТНБК. Исходя из этой концепции, можно также разработать животные модели тройно-негативного рака молочной железы с использованием CRISPR/Cas9-опосредованного удаления генов BRCA1 и p53, что приводит к потере репарации гомологичной рекомбинации, геномной нестабильности и мутантным фенотипам (Annunziato et al., 2020).
В настоящее время для диагностики трижды негативного рака молочной железы (ТНБК) используются различные методы, такие как маммография, магнитно-резонансная томография (МРТ) и ультразвуковое исследование. Однако эти методы имеют некоторые ограничения. Маммография используется для диагностики локализованных опухолей молочной железы, а не метастазов, когда раковые клетки мигрировали в другие органы. Ультразвуковое исследование не является надежным методом диагностики ТНБК (Чен и Ли-Фелкер, 2023). МРТ обладает более высокой чувствительностью, чем ультразвуковое исследование и маммография, но ее диагностическая точность ограничена (Ша и Чен, 2022). Биопсия тканей — инвазивный способ выявления раковых клеток. Однако в некоторых случаях биопсия может пропустить раковые ткани, если игла отклонится от интересующей области. Кроме того, это очень дорогостоящая процедура, которая может быть травматичной для пациента. ТНБК — гетерогенный тип рака, поэтому биопсия может не предоставить достаточно информации о типе рака. Следовательно, срочно необходим новый диагностически надежный метод выявления ТНБК. Система CRISPR/Cas9 может служить высокочувствительной и минимально инвазивной альтернативой для диагностики рака молочной железы. В этом контексте стратегии на основе CRISPR/Cas9 могут быть использованы для улучшения методов ПЦР для диагностики трижды негативного рака молочной железы (ТНБК). Сначала белки Cas9 и cpf1 системы CRISPR используются для удаления неспецифической ДНК, а затем эти два белка (Cas9 и cpf1) распознают последовательность PAM перед связыванием с целевой ДНК (Deepak Singh et al., 2021). Таким образом, ПЦР может выявлять мутации, связанные с развитием рака. В нескольких исследованиях эта стратегия на основе CRISPR применялась для обнаружения различных мутаций в разных видах рака (Safari et al., 2019). Таким образом, методы ПЦР на основе CRISPR могут снизить зависимость диагностики ТНБК от инвазивных методов, таких как иммуногистохимия на основе биопсии.
Генотипические изменения в регуляции гормональных рецепторов также были продемонстрированы при трижды негативном раке молочной железы (ТНБК) (Чен и Руссо, 2009). Стратегии ПЦР на основе CRISPR/Cas9 с использованием микроматриц для экспресс-диагностики могут эффективно отслеживать эти мутации (Хаджиан и др., 2019). Это также может предоставить медицинским работникам соответствующую информацию о конкретных мутациях у пациентов с ТНБК, что может помочь улучшить курс лечения. Однако эта комбинированная методика имеет ограничения. Поэтому необходимы обширные исследования, прежде чем этот метод CRISPR/Cas-ПЦР можно будет использовать в здравоохранении для диагностики ТНБК (Ян и др., 2019).
Дата публикации: 14 октября 2024 г.